ಪಿಸಿಆರ್ ಕಾರಕಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವುದು ಮತ್ತು ಅತ್ಯಂತ ಸೂಕ್ತವಾದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಔಪಚಾರಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸುಗಮ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪೂರ್ವಾಪೇಕ್ಷಿತಗಳಾಗಿವೆ.
ಆದ್ದರಿಂದ ನಾವು ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್ ಅನ್ನು ಹೇಗೆ ದೃಢೀಕರಿಸಬೇಕು?
ಮುಖ್ಯ ಸೂಚಕಗಳು ಬೇಸ್ಲೈನ್, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್, ಸಿಟಿ ಮೌಲ್ಯ, ವರ್ಧನೆ ದಕ್ಷತೆ, ಕಡಿಮೆ-ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮಾದರಿ ಪತ್ತೆ, ಸಿವಿ, ಇತ್ಯಾದಿ.
ಬೇಸ್ಲೈನ್
ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನಲ್ಲಿ ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಸಮತಲ ರೇಖೆಯಾಗಿದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲ ಕೆಲವು ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಹೆಚ್ಚು ಬದಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ನೇರ ರೇಖೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಸರಳ ರೇಖೆಯು ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಆಗಿದೆ.
ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಮಾಡುವಾಗ, ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿದೆಯೇ ಎಂದು ಗಮನ ಕೊಡಿ.ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಶುದ್ಧತೆಯು ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಏರಲು ಅಥವಾ ಬೀಳಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಬೇಸ್ಲೈನ್ ಕೂಡ ಬಹಳ ಅರ್ಥಗರ್ಭಿತ ಸೂಚಕವಾಗಿದೆ.
ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್
ಮತ್ತೊಂದು ಅರ್ಥಗರ್ಭಿತ ಸೂಚಕವು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ನ ಆಕಾರವಾಗಿದೆ.ದ್ವಿತೀಯ ವರ್ಧನೆ ಅಥವಾ ಇತರ ಅಸಹಜ ವರ್ಧನೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಎಸ್-ಆಕಾರದ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದು ಉತ್ತಮ.
Ct ಮೌಲ್ಯ
ಬೇಸ್‌ಲೈನ್‌ನಿಂದ ಘಾತೀಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯವರೆಗಿನ ಇನ್‌ಫ್ಲೆಕ್ಷನ್ ಪಾಯಿಂಟ್‌ಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ Ct ಮೌಲ್ಯವಾಗಿದೆ.
ಒಂದೇ ಮಾದರಿಗೆ, ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ವರ್ಧನೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ Ct ಮೌಲ್ಯವು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪದ ಮಟ್ಟದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ನ Ct ಮೌಲ್ಯವು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ, ಉತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.
ವರ್ಧನೆ ದಕ್ಷತೆ
ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವ ಅತ್ಯಂತ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರ ವಿಧಾನವೆಂದರೆ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್, ಇದನ್ನು ಸಂಶೋಧಕರು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಿದ್ದಾರೆ.ಗುರಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಮಾದರಿಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಮಾಡುವುದನ್ನು ವಿಧಾನವು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ.ಈ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರಗಳ ಸರಣಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ 10-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ.ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಮಾದರಿಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಬಳಸುವುದು, Cq ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ರಮಾಣಿತ qPCR ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಸೆಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ರೇಖೀಯ ಸಮೀಕರಣವನ್ನು ಪಡೆಯಲು Cq= -klgX0+b, ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ E=10(-1 /k)-1.ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ qPCR ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 90%-110% (3.6>k>3.1) ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿರಬೇಕು.
ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮಾದರಿಗಳ ಪತ್ತೆ
ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾದಾಗ, ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆ ದರಗಳು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ನಾವು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು 20 ಕಡಿಮೆ-ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪತ್ತೆ ದರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೈಮರ್-ಪ್ರೋಬ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.
ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಗುಣಾಂಕ (CV)
ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ವರ್ಧನೆ ಪತ್ತೆಗೆ ಕಾರಕದ ಸಾಲಿನ ಮಾನದಂಡದ ಪ್ರಕಾರ 10 ನಕಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿವಿಧ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು.
ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಕಾರಕಗಳು:
ನಿಖರತೆ
ಒಂದು ಬ್ಯಾಚ್‌ನೊಳಗಿನ ನಿಖರತೆಯು ಪೂರೈಸಬೇಕು: ಪರೀಕ್ಷಾ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗರಿಥಮಿಕ್ ಮೌಲ್ಯದ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಗುಣಾಂಕ (CV,%) ≤5% ಆಗಿದೆ.ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾದಾಗ, ಪತ್ತೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗರಿಥಮ್‌ನ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಗುಣಾಂಕ (CV,%) ≤10%
ಗುಣಾತ್ಮಕ ಕಾರಕಗಳು:
ನಿಖರತೆ
ಒಂದು ಬ್ಯಾಚ್‌ನಲ್ಲಿನ ನಿಖರತೆಯು ಪೂರೈಸಬೇಕು:
(1) Ct ಮೌಲ್ಯದ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಗುಣಾಂಕ (CV,%) ≤5%
ಅದೇ ಮಾದರಿಯನ್ನು 10 ಬಾರಿ ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಾ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರಬೇಕು
ಪೋಸ್ಟ್ ಸಮಯ: ಸೆಪ್ಟೆಂಬರ್-18-2021
