RT-qPCR ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ PCR ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದಿಂದ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ರಾಸಾಯನಿಕಗಳನ್ನು (ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈಗಳು ಅಥವಾ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಪ್ರೋಬ್ಸ್) ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅವುಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಕಾಶಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ನೈಜ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪನ್ನದ ಬದಲಾವಣೆಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಸಿಗ್ನಲ್ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಸ್ತುತ, ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿಧಾನಗಳೆಂದರೆ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ವಿಧಾನ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್ ವಿಧಾನ.

ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ವಿಧಾನ:
SYBR ಗ್ರೀನ್ Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ಇತ್ಯಾದಿಗಳಂತಹ ಕೆಲವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣಗಳು ತಾವಾಗಿಯೇ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ dsDNA ಯ ಮೈನರ್ ಗ್ರೂವ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, ಯಂತ್ರವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಅನೆಲಿಂಗ್-ವಿಸ್ತರಣೆ (ಎರಡು-ಹಂತದ ವಿಧಾನ) ಅಥವಾ ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಹಂತಕ್ಕೆ (ಮೂರು-ಹಂತದ ವಿಧಾನ) ಮುಂದುವರಿದಾಗ, ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೊಸ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣುಗಳನ್ನು dsDNA ಮೈನರ್ ಗ್ರೂವ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ, ಹೆಚ್ಚು ಹೆಚ್ಚು ಬಣ್ಣಗಳು ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ನಿರಂತರವಾಗಿ ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ.SYBR ಗ್ರೀನ್ Ⅰ ಅನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ.
ತನಿಖೆ ವಿಧಾನ:
ತಕ್ಮಾನ್ ಪ್ರೋಬ್ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ಶೋಧಕವಾಗಿದೆ.ತನಿಖೆಯ 5′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು ಇರುತ್ತದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ FAM.ತನಿಖೆಯು ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿದೆ.ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್‌ನ 3′ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಕ್ವೆನ್ಚಿಂಗ್ ಗುಂಪು ಇದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅನುರಣನ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆಯ ತತ್ವದ ಪ್ರಕಾರ (ಫಾರ್ಸ್ಟರ್ ಅನುರಣನ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆ, FRET), ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು (ದಾನಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣು) ಮತ್ತು ಕ್ವೆನ್ಚಿಂಗ್ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು (ಸ್ವೀಕರಿಸುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣು) ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅತಿಕ್ರಮಿಸಿದಾಗ (7 ದೂರವು ಅತಿಕ್ರಮಿಸಿದಾಗ) ಸ್ವೀಕಾರಕ ಅಣುವಿನ ಪ್ರತಿದೀಪಕತೆ, ಆಟೋಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, ತನಿಖೆಯು ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಮುಕ್ತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಅಖಂಡವಾಗಿದ್ದಾಗ, ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಹೊರಸೂಸುವುದಿಲ್ಲ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವಾಗ, ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ನಿರಂತರವಾಗಿ ಹೊಸ ಸರಪಳಿಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ.DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ 5′-3′ ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ತನಿಖೆಯನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಿಂದ ತನಿಖೆಯನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪನ್ನು ಕ್ವೆಂಚರ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಗುಂಪಿನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ತನಿಖೆ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಡುವೆ ಒಂದರಿಂದ ಒಂದು ಸಂಬಂಧವಿರುವುದರಿಂದ, ಪರೀಕ್ಷೆಯ ನಿಖರತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯ ದೃಷ್ಟಿಯಿಂದ ಪ್ರೋಬ್ ವಿಧಾನವು ಡೈ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.

ಚಿತ್ರ 1 qRT-PCR ತತ್ವ

ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ
ತತ್ವಗಳು:

ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಸರಣಿಯ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು.

cDNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಉತ್ತಮ, ಮತ್ತು mRNA ಅನುಕ್ರಮವು ಸಹ ಸ್ವೀಕಾರಾರ್ಹವಾಗಿದೆ.ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮದ ಸಿಡಿಎಸ್ ಪ್ರದೇಶದ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಿರಿ.
ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದವು 80-150bp ಆಗಿದೆ, ಉದ್ದವು 300bp ಆಗಿದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 17-25 ಬೇಸ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಇರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಪ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿರಬಾರದು.

G+C ವಿಷಯವು 40% ಮತ್ತು 60% ರ ನಡುವೆ ಇದೆ ಮತ್ತು 45-55% ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿದೆ.
TM ಮೌಲ್ಯವು 58-62 ಡಿಗ್ರಿಗಳ ನಡುವೆ ಇರುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಫ್-ಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ, (ಸತತ 4 ಜೋಡಿಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪೂರಕ ಬೇಸ್‌ಗಳು ಕಾಣಿಸುವುದಿಲ್ಲ) ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆ, ಅನಿವಾರ್ಯವಾದರೆ, ΔG<4.5kJ/mol* ಮಾಡಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ gDNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನೀವು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಿದ್ದರೆ, GDNA ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ. T/C, A/G ನಿರಂತರ ರಚನೆ (2-3) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅಲ್ಲದ
ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ವೈವಿಧ್ಯಮಯವಾಗಿ ವರ್ಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಅನುಕ್ರಮದ ಹೋಮೋಲಜಿಯು 70% ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅಥವಾ 8 ಪೂರಕ ಬೇಸ್ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.
ಡೇಟಾಬೇಸ್:
ಕೀವರ್ಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ CottonFGD ಹುಡುಕಾಟ
ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ:
IDT-qPCR ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ

Fig2 IDT ಆನ್‌ಲೈನ್ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಪರಿಕರ ಪುಟ

Fig3 ಫಲಿತಾಂಶ ಪುಟ ಪ್ರದರ್ಶನ
lncRNA ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ವಿನ್ಯಾಸ:
lncRNA:mRNA ಯಂತೆಯೇ ಅದೇ ಹಂತಗಳು.
miRNA:ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನದ ತತ್ವ: ಎಲ್ಲಾ miRNA ಗಳು ಸುಮಾರು 23 nt ಗಳ ಸಣ್ಣ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ನೇರ PCR ಪತ್ತೆ ಮಾಡಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಕಾಂಡ-ಲೂಪ್ ಅನುಕ್ರಮ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ಅನುಕ್ರಮವು ಸುಮಾರು 50 nt ನ ಏಕ-ತಂತಿಯ ಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಸ್ವತಃ ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.3 'ಅಂತ್ಯವನ್ನು miRNA ಭಾಗಶಃ ತುಣುಕಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು, ನಂತರ ಗುರಿ miRNA ಯನ್ನು ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಾಂಡ-ಲೂಪ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಉದ್ದವು 70bp ಅನ್ನು ತಲುಪಬಹುದು, ಇದು qPCR ನಿರ್ಧರಿಸಿದ ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಟೈಲಿಂಗ್ miRNA ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ.
ವರ್ಧನೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪತ್ತೆ:
ಆನ್‌ಲೈನ್ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್: ಅನುಕ್ರಮ ಹೋಲಿಕೆಯ ಮೂಲಕ CottonFGD ಬ್ಲಾಸ್ಟ್
ಸ್ಥಳೀಯ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್: ಸ್ಥಳೀಯ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಮಾಡಲು ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ + ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಲಿನಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮ್ಯಾಕೋಸ್ ನೇರವಾಗಿ ಸ್ಥಳೀಯ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು, ಉಬುಂಟು ಬ್ಯಾಷ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದ ನಂತರ ವಿನ್ 10 ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಮಾಡಬಹುದು.ಸ್ಥಳೀಯ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಮತ್ತು ಸ್ಥಳೀಯ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಿ;win10 ನಲ್ಲಿ ಉಬುಂಟು ಬ್ಯಾಷ್ ತೆರೆಯಿರಿ.
ಗಮನಿಸಿ: ಅಪ್ಲ್ಯಾಂಡ್ ಹತ್ತಿ ಮತ್ತು ಸೀ ಐಲ್ಯಾಂಡ್ ಹತ್ತಿ ಟೆಟ್ರಾಪ್ಲಾಯ್ಡ್ ಬೆಳೆಗಳು, ಆದ್ದರಿಂದ ಸ್ಫೋಟದ ಫಲಿತಾಂಶವು ಎರಡು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪಂದ್ಯಗಳಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಹಿಂದೆ, NAU ಸಿಡಿಗಳನ್ನು ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಮಾಡಲು ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಆಗಿ ಬಳಸುವುದರಿಂದ ಕೆಲವು SNP ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಏಕರೂಪದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಎರಡು ಏಕರೂಪದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅವುಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಇಂಡೆಲ್ ಇದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಇಂಡೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಉಚಿತ ಶಕ್ತಿಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಅನಿವಾರ್ಯವಾಗಿದೆ.

ಪ್ರೈಮರ್ ಸೆಕೆಂಡರಿ ರಚನೆಯ ಪತ್ತೆ:
ಹಂತಗಳು:ಓಪನ್ ಒಲಿಗೋ 7 → ಇನ್‌ಪುಟ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನುಕ್ರಮ → ಕ್ಲೋಸ್ ಸಬ್-ವಿಂಡೋ → ಸೇವ್ → ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ctrl+D ಅನ್ನು ಒತ್ತಿ → ಸೆಲ್ಫ್-ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಬಾಡಿ, ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್, ಹೇರ್‌ಪಿನ್, ಅಸಾಮರಸ್ಯ, ಇತ್ಯಾದಿಗಳಂತಹ ವಿವಿಧ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿ. ಚಿತ್ರ4 ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಕೊನೆಯ ಎರಡು ಫಲಿತಾಂಶಗಳಾಗಿವೆ.ಮುಂಭಾಗದ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಫಲಿತಾಂಶವು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ, ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಡೈಮರ್ ಮತ್ತು ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಯಿಲ್ಲ, ನಿರಂತರ ಪೂರಕ ಬೇಸ್‌ಗಳಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಉಚಿತ ಶಕ್ತಿಯ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮೌಲ್ಯವು 4.5 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಬ್ಯಾಕ್ ಪ್ರೈಮರ್ ನಿರಂತರ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ 6 ಬೇಸ್‌ಗಳು ಪೂರಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಉಚಿತ ಶಕ್ತಿಯು 8.8 ಆಗಿದೆ;ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಗಂಭೀರವಾದ ಡೈಮರ್ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 4 ಸತತ ಬೇಸ್‌ಗಳ ಡೈಮರ್ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಉಚಿತ ಶಕ್ತಿಯು ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲದಿದ್ದರೂ, 3′ ಡೈಮರ್ Chl ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಗಂಭೀರವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಹೇರ್‌ಪಿನ್‌ಗಳು, ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅಸಾಮರಸ್ಯಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ.

Fig3 oligo7 ಪತ್ತೆ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು
ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಪತ್ತೆ:
ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಗಂಭೀರವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.qRT-PCR ನಲ್ಲಿ, ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗಾಗಿ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಇತರ ವಸ್ತುಗಳು, ಯಂತ್ರಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟವು qRT-PCR ನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ನಿಖರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ qRT-PCR ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 85% ಮತ್ತು 115% ರ ನಡುವೆ ಇದೆ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎರಡು ವಿಧಾನಗಳಿವೆ:
1. ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ವಿಧಾನ:
ಎ.ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ
ಬಿ.ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ
c.qPCR
ಡಿ.ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ರೇಖೀಯ ಹಿಂಜರಿತ ಸಮೀಕರಣ
2. LinRegPCR
LinRegPCR ನೈಜ ಸಮಯದ RT-PCR ಡೇಟಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಒಂದು ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಆಗಿದೆ, ಇದನ್ನು SYBR ಗ್ರೀನ್ ಅಥವಾ ಅಂತಹುದೇ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR (qPCR) ಡೇಟಾ ಎಂದೂ ಕರೆಯುತ್ತಾರೆ.ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಅಲ್ಲದ ಸರಿಪಡಿಸಿದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ತಿದ್ದುಪಡಿಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ, ರೇಖಾತ್ಮಕತೆಯ ವಿಂಡೋವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಪಿಸಿಆರ್ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಮೂಲಕ ನೇರ ರೇಖೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ರೇಖೀಯ ಹಿಂಜರಿತ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಈ ರೇಖೆಯ ಇಳಿಜಾರಿನಿಂದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಮಾದರಿಯ ಪಿಸಿಆರ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗೆ ಸರಾಸರಿ PCR ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಡೇಟಾ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಮತ್ತು ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಎಕ್ಸೆಲ್ ಸ್ಪ್ರೆಡ್‌ಶೀಟ್ ಮೂಲಕ.ಮಾದರಿ ಮಾತ್ರ
ಮಿಶ್ರಣದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಯಾವುದೇ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಇಲ್ಲ
ಕ್ರಮಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ:(ಬೋಲ್ CFX96 ಅನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ, ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ABI ಜೊತೆಗೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಯಂತ್ರವಲ್ಲ)
ಪ್ರಯೋಗ:ಇದು ಪ್ರಮಾಣಿತ qPCR ಪ್ರಯೋಗವಾಗಿದೆ.
qPCR ಡೇಟಾ ಔಟ್‌ಪುಟ್:LinRegPCR ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಫೈಲ್‌ಗಳ ಎರಡು ರೂಪಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು: RDML ಅಥವಾ ಪರಿಮಾಣ ವರ್ಧನೆಯ ಫಲಿತಾಂಶ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಇದು ಯಂತ್ರದಿಂದ ಸೈಕಲ್ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪತ್ತೆ ಮೌಲ್ಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರೇಖೀಯ ವಿಭಾಗದ ದಕ್ಷತೆಯ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬದಲಾವಣೆಯ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ ವರ್ಧನೆಯು ಪಡೆಯಲ್ಪಡುತ್ತದೆ.
ಡೇಟಾ ಆಯ್ಕೆ: ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿ, RDML ಮೌಲ್ಯವು ಬಳಸಬಹುದಾದಂತಿರಬೇಕು.ನನ್ನ ಕಂಪ್ಯೂಟರ್‌ನ ಸಮಸ್ಯೆಯೆಂದರೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ RDML ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ ಎಂದು ಅಂದಾಜಿಸಲಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ನಾನು ಮೂಲ ಡೇಟಾದಂತೆ ಎಕ್ಸೆಲ್ ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದೇನೆ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವಲ್ಲಿ ವಿಫಲವಾದಂತಹ ಡೇಟಾದ ಒರಟು ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಮೊದಲು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಡೇಟಾದಲ್ಲಿ ಪಾಯಿಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಅಳಿಸಬಹುದು (ಸಹಜವಾಗಿ, ನೀವು ಅವುಗಳನ್ನು ಅಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ನಂತರದ ಹಂತದಲ್ಲಿ LinRegPCR ಈ ಅಂಶಗಳನ್ನು ನಿರ್ಲಕ್ಷಿಸುತ್ತದೆ)

Fig5 qPCR ಡೇಟಾ ರಫ್ತು

ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಮಾದರಿಗಳ ಚಿತ್ರ 6 ಆಯ್ಕೆ

ಡೇಟಾ ಇನ್ಪುಟ್:ಅರ್ಹತಾ ವರ್ಧನೆ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು.xls ತೆರೆಯಿರಿ, → ತೆರೆದ LinRegPCR → ಫೈಲ್ → ಎಕ್ಸೆಲ್ ನಿಂದ ಓದಿ → ಚಿತ್ರ 7 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ → ಸರಿ → ಬೇಸ್‌ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ ಕ್ಲಿಕ್ ಮಾಡಿ

linRegPCR ಡೇಟಾ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ನ Fig7 ಹಂತಗಳು

ಫಲಿತಾಂಶ:ಯಾವುದೇ ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಯಾವುದೇ ಗುಂಪು ಮಾಡುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ.ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಇದ್ದರೆ, ಗುಂಪು ಮಾಡುವಿಕೆಯನ್ನು ಮಾದರಿ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಸಂಪಾದಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಜೀನ್‌ನ ಹೆಸರನ್ನು ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ನಮೂದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಅದೇ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಗುಂಪು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಫೈಲ್ ಅನ್ನು ಕ್ಲಿಕ್ ಮಾಡಿ, ಎಕ್ಸೆಲ್ ಅನ್ನು ರಫ್ತು ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸಿ.ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಯ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು R2 ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, ನೀವು ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ ವಿಭಜಿಸಿದರೆ, ಸರಿಪಡಿಸಿದ ಸರಾಸರಿ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 85% ಮತ್ತು 115% ನಡುವೆ ಇದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.ಇದು ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಕಳಪೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಅರ್ಥ.

ಚಿತ್ರ 8 ಫಲಿತಾಂಶ ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ಔಟ್‌ಪುಟ್

ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ:
ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳು:
ಶುದ್ಧತೆ:1.7ಉಳಿದಿರುವ ಐಸೊಥಿಯೋಸೈನೇಟ್ ಇರಬಹುದೆಂದು 2.0 ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕ್ಲೀನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ A260/A230 ಸುಮಾರು 2 ಆಗಿರಬೇಕು .230 nm ನಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಇದ್ದರೆ, ಫಿನೇಟ್ ಅಯಾನುಗಳಂತಹ ಸಾವಯವ ಸಂಯುಕ್ತಗಳಿವೆ ಎಂದು ಅದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಜೊತೆಗೆ, ಇದನ್ನು 1.5% ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು.ಮಾರ್ಕರ್ ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸಿ, ಏಕೆಂದರೆ ssRNA ಯಾವುದೇ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಲಾಗರಿಥಮ್ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಏಕಾಗ್ರತೆ: ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕವಾಗಿಅಲ್ಲ100ng/ul ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ, ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಶುದ್ಧತೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಎತ್ತರವಲ್ಲ

Fig9 RNA ಜೆಲ್

ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಮಾದರಿಯು ಅಮೂಲ್ಯವಾಗಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಅಧಿಕವಾಗಿದ್ದರೆ, ಹೊರತೆಗೆದ ನಂತರ ಅದನ್ನು ಅಲಿಕ್ಟ್ ಮಾಡಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು 100-300ng/ul ನ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ.ರಲ್ಲಿಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ, mRNAಯನ್ನು ಲಿಪ್ಯಂತರಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ polyA ಟೈಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಬಹುದಾದ oligo (dt) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ lncRNA ಮತ್ತು circRNA ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಹೆಕ್ಸಾಮರ್ (ರ್ಯಾಂಡಮ್ 6 ಮರ್) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಅನೇಕ ಕಂಪನಿಗಳು ಈಗ ವಿಶೇಷ ಟೈಲಿಂಗ್ ಕಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆ.ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನಕ್ಕೆ, ಟೈಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನವು ಹೆಚ್ಚು ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಮತ್ತು ಕಾರಕ-ಉಳಿತಾಯವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಒಂದೇ ಕುಟುಂಬದ miRNA ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುವ ಪರಿಣಾಮವು ಕಾಂಡ-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನದಂತೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿರಬಾರದು.ಪ್ರತಿಯೊಂದು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಕಿಟ್ ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ (ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ಸ್) ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.miRNA ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾದ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವು U6 ಆಗಿದೆ.ಕಾಂಡ-ಲೂಪ್ ವಿಲೋಮ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, U6 ನ ಟ್ಯೂಬ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಹಿಮ್ಮುಖಗೊಳಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು U6 ನ ಮುಂಭಾಗ ಮತ್ತು ಹಿಂಭಾಗದ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಸೇರಿಸಬೇಕು.CircRNA ಮತ್ತು lncRNA ಎರಡೂ HKG ಗಳನ್ನು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.ರಲ್ಲಿcDNA ಪತ್ತೆ,
ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಕೂಡ ಉತ್ತಮವಾಗಿರಬೇಕು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರಯೋಗದ ಪರಿಪೂರ್ಣತೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿದರೆ, ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ (ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್, RG) ಇದು gDNA ಯನ್ನು ಸಿಡಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, RG ಒಂದು ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್ ಆಗಿದೆ., HKG) ಚಿತ್ರ 10 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ;ಆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ನಾನು ಸೋಯಾಬೀನ್ ಶೇಖರಣಾ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ತಯಾರಿಸುತ್ತಿದ್ದೆ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆಕ್ಟಿನ್ 7 ಅನ್ನು ಬಳಸಿದೆ.gDNA ಯಲ್ಲಿನ ಈ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ವರ್ಧಿತ ತುಣುಕಿನ ಗಾತ್ರವು 452bp ಆಗಿತ್ತು, ಮತ್ತು cDNA ಅನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಿದರೆ, ಅದು 142bp ಆಗಿತ್ತು.ನಂತರ ಪರೀಕ್ಷಾ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು cDNA ಯ ಭಾಗವು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ gDNA ಯಿಂದ ಕಲುಷಿತಗೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಫಲಿತಾಂಶದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲ ಎಂದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು ಇದನ್ನು PCR ಗಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ cDNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಲಾಯಿಸಲು ಇದು ನಿಷ್ಪ್ರಯೋಜಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಇದು ಒಂದು ಪ್ರಸರಣ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಮನವರಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

ಚಿತ್ರ 10 cDNA ಪತ್ತೆ

qPCR ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ನಿರ್ಣಯಕಿಟ್‌ನ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ tm ಮೌಲ್ಯದ ಹಂತದಲ್ಲಿ.ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸದಿದ್ದರೆ, tm ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ 60 ° C ನಡುವಿನ ದೊಡ್ಡ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಿದರೆ, cDNA ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬೆರೆಸಿದ ನಂತರ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ PCR ಅನ್ನು ರನ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು TM ಮೌಲ್ಯದಂತೆ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳಿಲ್ಲದೆ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ ಎಂದು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಮಾಹಿತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ

ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಸಂಸ್ಕರಣಾ ವಿಧಾನವು ಮೂಲತಃ 2 ರ ಪ್ರಕಾರವಾಗಿದೆ-ΔΔCT.ಡೇಟಾ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್.

ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:

ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸುಲಭ^TM -ತಕ್ಮಾನ್

ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸುಲಭ^TM -ಸಿಬಿಆರ್ ಗ್ರೀನ್ ಐ

ಆರ್ಟಿ ಈಸಿ I (ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರಿಮಿಕ್ಸ್)

RT ಸುಲಭ II (qPCR ಗಾಗಿ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರೀಮಿಕ್ಸ್)