一, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

1. ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ:

ಯಶಸ್ವಿ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್ಎನ್ಎಯಿಂದ ಬರುತ್ತದೆ.ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕನಿಷ್ಠ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದವಾಗಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಇಡಿಟಿಎ ಅಥವಾ ಎಸ್‌ಡಿಎಸ್‌ನಂತಹ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳಿಂದ ಮುಕ್ತವಾಗಿರಬೇಕು.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವು ನೀವು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಬಹುದಾದ ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರಮಾಣದ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನವು ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಐಸೊಥಿಯೋಸೈನೇಟ್/ಆಸಿಡ್ ಫೀನಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಒಂದು-ಹಂತದ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.RNase ನ ಜಾಡಿನ ಪ್ರಮಾಣದಿಂದ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು, RNase-ಸಮೃದ್ಧ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ (ಮೇದೋಜ್ಜೀರಕ ಗ್ರಂಥಿಯಂತಹ) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ RNA ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.ಇಲಿ ಪಿತ್ತಜನಕಾಂಗದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ಒಂದು ವಾರದವರೆಗೆ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಶೇಖರಿಸಿದ ನಂತರ ಕ್ಷೀಣಿಸಿತು, ಆದರೆ ಇಲಿ ಗುಲ್ಮದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ 3 ವರ್ಷಗಳ ಕಾಲ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಶೇಖರಿಸಿದ ನಂತರ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, 4 kb ಗಿಂತ ಉದ್ದದ ಪ್ರತಿಗಳು ಸಣ್ಣ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಿಗಿಂತ ಜಾಡಿನ RNases ನಿಂದ ಅವನತಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ಫಾರ್ಮಮೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು -70 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲು ಬಳಸುವ ಫಾರ್ಮಾಮೈಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ-ಡಿಗ್ರೇಡಿಂಗ್ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ಮುಕ್ತವಾಗಿರಬೇಕು.ಮೇದೋಜ್ಜೀರಕ ಗ್ರಂಥಿಯಿಂದ ಬರುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ವರ್ಷದವರೆಗೆ ಫಾರ್ಮಮೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಬಹುದು.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಬಳಸಲು ತಯಾರಿ ನಡೆಸುವಾಗ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲು ನೀವು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು: NaCl ಅನ್ನು 0.2M ಗೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಎಥೆನಾಲ್‌ನ 4 ಪಟ್ಟು ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 3-5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 10,000×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ.

2. RNaseH-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ (RNaseH-) ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಬಳಸಿ:

cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಉದ್ದ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬಫರ್ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ಏಜೆಂಟ್ (ಡಿಟಿಟಿಯಂತಹ) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರ್ಯಾಂಡ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಬೇಕು ಏಕೆಂದರೆ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮುಂಚಿನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ನಿರಾಕರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ RNA ಯನ್ನು ಕೆಡಿಸುವ ಬೌಂಡ್ RNase ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್ RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು RNase A, B, C ನಿಂದ RNA ಯ ಅವನತಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಚರ್ಮದ ಮೇಲೆ RNase ಅನ್ನು ತಡೆಯುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳ ಬಳಕೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ ನಿಮ್ಮ ಬೆರಳುಗಳಿಂದ RNase ಅನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸದಂತೆ ಎಚ್ಚರಿಕೆ ವಹಿಸಿ.

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ.M-MLV ಮತ್ತು AMV ಎರಡೂ ತಮ್ಮದೇ ಆದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಜೊತೆಗೆ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರೈಮರ್ ಅಥವಾ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಎಕ್ಸ್‌ಟೆನ್ಶನ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ನಡುವೆ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಸೆಹೆಚ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಸ್ಪರ್ಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ:ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಕೆಡಿಸುತ್ತದೆ.RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ಕೆಡಿಸಿದ RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಇನ್ನು ಮುಂದೆ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಇದು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಇಳುವರಿ ಮತ್ತು ಉದ್ದವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನ RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಇದು ಪ್ರಯೋಜನಕಾರಿಯಾಗಿದೆ.

ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ Ⅱ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್, RNaseH- MMLV ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್, RNaseH- AMV, MMLV ಮತ್ತು AMV ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಮತ್ತು ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಅನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದು.RT-PCR ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಮಾಣದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ AMV ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.RT-PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಗಾತ್ರವು cDNA ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದಿಂದ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ cDNA ಗಳನ್ನು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡುವಾಗ.MMLV ಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, SuperScripⅡ ದೀರ್ಘ RT-PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ.RNaseH-ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಸಹ ಥರ್ಮೋಸ್ಟಾಬಿಲಿಟಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ 37-42 ° C ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಒಲಿಗೋ(dT) ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು [α-P]dCTP ಯ 10 μCi ಅನ್ನು ಬಳಸಿ.ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಒಟ್ಟು ಇಳುವರಿಯನ್ನು TCA ಮಳೆಯ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಅನ್ನು ಗಾತ್ರ-ವಿಂಗಡಿಸಿದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಷಾರೀಯ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಣಿಸಲಾಗಿದೆ.

3. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನಕ್ಕಾಗಿ ಕಾವು ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾವು ತಾಪಮಾನವು ಆರ್ಎನ್ಎ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, ಬಫರ್ ಅಥವಾ ಉಪ್ಪು ಇಲ್ಲದೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು 65 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವುದು, ನಂತರ ಐಸ್‌ನ ಮೇಲೆ ಕ್ಷಿಪ್ರ ತಂಪಾಗಿಸುವಿಕೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೆಲವು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಇನ್ನೂ ಹೀಟ್ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ನಂತರವೂ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಈ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ವರ್ಧನೆಯು ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಬಹುದು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾವು ತಾಪಮಾನಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು (GSP) cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಿದಾಗ (ಅಧ್ಯಾಯ 3 ನೋಡಿ).GSP ಬಳಸುತ್ತಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ Tm ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಕಾವು ತಾಪಮಾನದಂತೆಯೇ ಇದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.60°C ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಆಲಿಗೋ(dT) ಮತ್ತು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಡಿ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳಿಗೆ 60 ° C ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೊದಲು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಬಳಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ/ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು 65 °C ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನದಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಶನ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ನೇರವಾಗಿ ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಪೂರ್ವ-ಬೆಚ್ಚಗಿನ 2× ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು (ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಈ ವಿಧಾನವು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಇಂಟರ್ಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಬೇಸ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.RT-PCR ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಬಹು ತಾಪಮಾನ ಸ್ವಿಚಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಥರ್ಮಲ್ ಸೈಕ್ಲರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸರಳಗೊಳಿಸಬಹುದು.

Tth ಥರ್ಮೋಸ್ಟೆಬಲ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ Mg2+ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಆಗಿ ಮತ್ತು Mn2+ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಇದನ್ನು ಗರಿಷ್ಠ 65 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಬೆಚ್ಚಗಾಗಿಸಬಹುದು.ಆದಾಗ್ಯೂ, PCR ಸಮಯದಲ್ಲಿ Mn2+ ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ನಿಷ್ಠೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು Tth ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು cDNA ಯ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್‌ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚಿನ-ನಿಖರವಾದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಡಿಮೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿಸುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, Tth ಕಡಿಮೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು PCR ಅನ್ನು ಒಂದೇ ಕಿಣ್ವದಿಂದ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದಾದ್ದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇಲ್ಲದೆ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು cDNA ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಕಲುಷಿತಗೊಳಿಸುವ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ.

4. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳು:

ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಮತ್ತು DMSO ಸೇರಿದಂತೆ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳನ್ನು ಮೊದಲ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ಬಿಚ್ಚುತ್ತದೆ.ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಅಥವಾ MMLV ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಬಾಧಿಸದೆಯೇ 20% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಅಥವಾ 10% DMSO ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು.AMV ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಷ್ಟವಿಲ್ಲದೆ 20% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಸಹಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ನಲ್ಲಿ RT-PCR ನ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು, 10% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಅನ್ನು 45 °C ನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು.ಪಿಸಿಆರ್‌ಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ 1/10 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿದರೆ, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 0.4% ಆಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು ಸಾಕಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

5. RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆ:

ಪಿಸಿಆರ್‌ಗೆ ಮೊದಲು RNaseH ನೊಂದಿಗೆ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು.ಕೆಲವು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ RNAಯು ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ, ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಕಡಿಮೆ-ನಕಲು ಟ್ಯೂಬರಸ್ ಸ್ಕೆರೋಸಿಸ್ II ನಂತಹ ದೀರ್ಘ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಗುರಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸುವಾಗ RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ.ಈ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಾಗಿ, RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಅಥವಾ AMV-ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ cDNA ನಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಸಂಕೇತವನ್ನು ವರ್ಧಿಸಿತು.ಹೆಚ್ಚಿನ RT-PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ, RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಐಚ್ಛಿಕವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ 95 ° C ನಲ್ಲಿ PCR ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಹಂತವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ RNA:DNA ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ RNA ಅನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

6. ಸಣ್ಣ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನದ ಸುಧಾರಣೆ:

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕೇವಲ ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಲಭ್ಯವಿರುವಾಗ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸವಾಲಾಗಿದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವಾಹಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾದ ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್ ಸಣ್ಣ ಮಾದರಿಗಳ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಟ್ರೈಝೋಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ RNase-ಮುಕ್ತ ಗ್ಲೈಕೋಜೆನ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಮಳೆಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡಲು ಆರ್ಎನ್ಎ ಜೊತೆ ಜಲೀಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಬಹುದು.50 mg ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅಂಗಾಂಶ ಅಥವಾ 106 ಕಲ್ಚರ್ಡ್ ಕೋಶಗಳ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, RNase-ಮುಕ್ತ ಗ್ಲೈಕೋಜೆನ್‌ನ ಶಿಫಾರಸು ಸಾಂದ್ರತೆಯು 250 μg/ml ಆಗಿದೆ.

ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ಗೆ ಅಸಿಟೈಲೇಟೆಡ್ ಬಿಎಸ್‌ಎ ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ, ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ನೇಸ್‌ಔಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಇನ್‌ಹಿಬಿಟರ್‌ನ 40 ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಪತ್ತೆಯ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಬಳಸುವಾಗ ಬಿಎಸ್‌ಎ ಅಥವಾ ಆರ್‌ನೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಇನ್ನೂ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

二, RT-PCR ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ

1. CND ಅಸಿಂಥೆಸಿಸ್:

ಮೊದಲ-ತಂತಿಯ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಬಹುದು, ಅದರ ಸಂಬಂಧಿತ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.

ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿಧಾನವು ಮೂರು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಬಹು ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅನೆಲ್, ಸಣ್ಣ, ಭಾಗಶಃ-ಉದ್ದದ cDNA ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ.5′ ಅಂತ್ಯದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನಿಂದ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗದ ಮುಕ್ತಾಯದ ಸೈಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಂದ cDNA ಪಡೆಯಲು ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಆಗಾಗ್ಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉದ್ದವಾದ cDNA ಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ಪ್ರತಿ RNA ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನುಪಾತವನ್ನು RNA ಗೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪ್ರತಿ 20 μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ 50 ರಿಂದ 250 ng ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿರುವುದರಿಂದ ಪ್ರಾಥಮಿಕವಾಗಿ ರೈಬೋಸೋಮಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಪಾಲಿ(ಎ)+ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಒಲಿಗೊ(dT) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಇದು ಬಹುಪಾಲು ಯೂಕ್ಯಾರಿಯೋಟಿಕ್ mRNAಗಳ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪಾಲಿ(A) ಬಾಲಕ್ಕೆ ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ ಆಗುತ್ತದೆ.ಪಾಲಿ(A)+ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಸರಿಸುಮಾರು 1% ರಿಂದ 2% ಆಗಿರುವುದರಿಂದ, cDNA ಯ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಅದರ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯಿಂದಾಗಿ, ಒಲಿಗೊ (dT) ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪಾಲಿ(ಎ)+ ಆಯ್ಕೆಯ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ.20μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ 0.5μg ಆಲಿಗೋ(dT) ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ RT-PCR ಗೆ oligo(dT)12-18 ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಒಲಿಗೋ(ಡಿಟಿ)20 ಅನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾವು ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಉತ್ತಮ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ.

ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (GSP) ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಹಂತಕ್ಕೆ ಅತ್ಯಂತ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಾಗಿವೆ.GSP ಎಂಬುದು ಒಂದು ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಆಗಿದ್ದು, ಇದು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ ಮಾಡಬಹುದು, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಆಲಿಗೋ(ಡಿಟಿ) ಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಇದು ಎಲ್ಲಾ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳಿಗೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸುವ ಅದೇ ನಿಯಮಗಳು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಜಿಎಸ್‌ಪಿ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕೂ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತವೆ.GSP ಯು mRNA ಯ 3′-ಅತ್ಯಂತ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡುವ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ನಂತೆಯೇ ಅದೇ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿರಬಹುದು ಅಥವಾ GSP ಅನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಕೆಳಕ್ಕೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು.ಕೆಲವು ವರ್ಧಿತ ವಿಷಯಗಳಿಗೆ, ಯಶಸ್ವಿ RT-PCR ಗಾಗಿ ಒಂದಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಗುರಿ RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಪ್ರೈಮರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು.20 μl ಫಸ್ಟ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ 1 pmol ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ GSP ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

2. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನಕ್ಕಾಗಿ ಕಾವು ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

GSP ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಯೋಜನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ಹೆಚ್ಚಿನ ಥರ್ಮೋಸ್ಟೆಬಿಲಿಟಿ ಹೊಂದಿರುವ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು.ಥರ್ಮೋಸ್ಟೇಬಲ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 55°C ನಲ್ಲಿ GSP ಅನೆಲ್ ಆಗಿದ್ದರೆ, AMV ಅಥವಾ M-MLV ಯನ್ನು 37°C ಯ ಕಡಿಮೆ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಿದರೆ GSP ಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ II ಮತ್ತು ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ 50 ° C ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಬಹುದು, ಇದು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.ಗರಿಷ್ಟ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗಾಗಿ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ/ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ 65 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನದಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇನ್‌ಕ್ಯುಬೇಶನ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಪೂರ್ವ-ಬೆಚ್ಚಗಿನ 2× ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ (ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್) ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಇದು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಬೇಸ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಥರ್ಮಲ್ ಸೈಕ್ಲರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು RT-PCR ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಬಹು ತಾಪಮಾನ ಪರಿವರ್ತನೆಗಳನ್ನು ಸರಳಗೊಳಿಸಬಹುದು.

3. ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ:

ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎದುರಾಗುವ ಸಂಭಾವ್ಯ ತೊಂದರೆಯೆಂದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿನ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯ.ಟ್ರೈಝೋಲ್ ರೀಜೆಂಟ್‌ನಂತಹ ಉತ್ತಮ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ತಯಾರಿಕೆಯನ್ನು ಕಲುಷಿತಗೊಳಿಸುವ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಪಡೆದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗೆ ಮೊದಲು ಕಲುಷಿತ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ವರ್ಧನೆ-ದರ್ಜೆಯ ಡಿನೇಸ್ I ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಬಹುದು.DNase I ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 2.0 mM EDTA ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 65 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.EDTA ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ಚೆಲೇಟ್ ಮಾಡಬಹುದು, ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನು-ಅವಲಂಬಿತ RNA ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.

ಕಲುಷಿತ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಂದ ವರ್ಧಿತ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು, ಪ್ರತಿ ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು.cDNA ಯಿಂದ ಪಡೆದ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಕಲುಷಿತ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ದಿಂದ ಪಡೆದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಗಿಂತ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇಲ್ಲದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಕೊಟ್ಟಿರುವ ತುಣುಕನ್ನು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅಥವಾ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು.ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವಿಲ್ಲದೆ ಪಡೆದ PCR ಉತ್ಪನ್ನವು ಜೀನೋಮ್‌ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.