Ⅰ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

1. ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್ಎನ್ಎ:

ಯಶಸ್ವಿ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್ಎನ್ಎಯಿಂದ ಬರುತ್ತದೆ.ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯು ಕನಿಷ್ಟ ಒಟ್ಟು ದೀರ್ಘಾವಧಿಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು ಮತ್ತು EDTA ಅಥವಾ SDS ನಂತಹ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವು ನೀವು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಬಹುದಾದ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯ ಗರಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನವು ಐಸೊಸೈನೇಟ್/ಆಸಿಡೋಫೆನಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಒಂದು ಹಂತದ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.RNase ನ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟುವ ಸಲುವಾಗಿ, RNase (ಮೇದೋಜೀರಕ ಗ್ರಂಥಿಯಂತಹ) ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿರುವ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಬೇರ್ಪಟ್ಟ RNA ಗೆ ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಉಳಿಸಲು ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್‌ನ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ ಇನ್ನೂ ಹೆಚ್ಚು.ಇಲಿ ಯಕೃತ್ತಿನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಒಂದು ವಾರದ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ನಂತರ ಕ್ಷೀಣಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇಲಿ ಗುಲ್ಮದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮೂರು ವರ್ಷಗಳ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ನಂತರ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಜೊತೆಗೆ, 4kb ಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾದ ಪ್ರತಿಗಳು ಸಣ್ಣ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಿಗಿಂತ RNase ಅವನತಿಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಶೇಖರಣಾ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಯ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಸಲುವಾಗಿ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಅಯಾನಿನ ಮೆಥಾಲ್‌ಮಮೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು -70 °C ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಉಳಿಸಲು ಬಳಸುವ ಥೈಲೈಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಕುಗ್ಗಿಸುವ ವಿವಿಧ ವಸ್ತುವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಾರದು.ಮೇದೋಜ್ಜೀರಕ ಗ್ರಂಥಿಯಿಂದ ಪಡೆದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ವರ್ಷದವರೆಗೆ ಮೆಥಾಲ್‌ಮಮೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಉಳಿಸಬಹುದು.ನೀವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಬಳಸಲು ಸಿದ್ಧರಾದಾಗ, ನೀವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು: NaCl ಅನ್ನು 0.2m ಗೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಎಥೆನಾಲ್‌ನ 4 ಪಟ್ಟು ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶವನ್ನು 3-5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು 10,000 × g ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಿ.

2. RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆ (RNaseH-) ಇಲ್ಲದೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಬಳಸಿ:

cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಉದ್ದ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಬಫರ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸರಪಳಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು DTT ಯಂತಹ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಪೂರ್ವ-ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ನಿರಾಕರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕ್ಷೀಣಿಸುವ ಬೌಂಡ್ ಆರ್‌ನೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್ RNase ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು RNase A, B, C ನಿಂದ RNA ಯ ಅವನತಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಚರ್ಮದ ಮೇಲೆ RNase ಗಳನ್ನು ತಡೆಯುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳ ಬಳಕೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ ಬೆರಳುಗಳಿಂದ RNase ಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸದಂತೆ ಎಚ್ಚರಿಕೆ ವಹಿಸಬೇಕು.

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ.M-MLV ಮತ್ತು AMV ಎರಡೂ ತಮ್ಮದೇ ಆದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಜೊತೆಗೆ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಎಕ್ಸ್‌ಟೆನ್ಶನ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೆಟೆರೊಜೈಗಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಸೆಹೆಚ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಸ್ಪರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಕುಗ್ಗಿಸುತ್ತದೆ.RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ಕೆಡಿಸಿದ RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಇನ್ನು ಮುಂದೆ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ತಲಾಧಾರಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಇಳುವರಿ ಮತ್ತು ಉದ್ದವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಹೀಗಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನ RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು ಉತ್ತಮ ಪ್ರಯೋಜನವನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.

ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್, RNaseH-ನ MMLV ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್, RNaseH-ನ AMV MMLV ಮತ್ತು AMV ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಅನ್ನು ನೀಡಿತು.RT-PCR ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಪ್ರಮಾಣದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ AMV ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.RT-PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಗಾತ್ರವು cDNA ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದಿಂದ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ Cdnas ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡುವಾಗ.MMLV ಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, SuperScripⅡ ದೀರ್ಘ RT-PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ.RNaseH-ನ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಸಹ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ 37-42℃ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಬಹುದು.ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಒಲಿಗೊ(dT) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 10μCi [ಆಲ್ಫಾ-ಪಿ]dCTP ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಮೊದಲ ಸರಪಳಿಯ ಒಟ್ಟು ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು TCA ಅವಕ್ಷೇಪನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಅನ್ನು ಗಾತ್ರ-ವಿಂಗಡಿಸಿದ ಸ್ಟ್ರಿಪ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಕ್ಷಾರೀಯ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಣಿಸುವ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.

3. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಶಾಖ ಸಂರಕ್ಷಣೆ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

ಹೆಚ್ಚಿನ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನವು RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಬಫರ್ ಅಥವಾ ಉಪ್ಪು ಇಲ್ಲದೆ 65 ° C ನಲ್ಲಿ ಹಿಡಿದಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳುವುದು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅವುಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ ತಂಪಾಗಿಸುವುದು ಹೆಚ್ಚಿನ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೆಲವು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಥರ್ಮಲ್ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ನಂತರವೂ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಈ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ವರ್ಧನೆಯು ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು (GSPS) ಬಳಸಿಕೊಂಡು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ನಡೆಸಿದಾಗ (ಅಧ್ಯಾಯ 3 ನೋಡಿ).GSP ಬಳಸುತ್ತಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ Tm ಮೌಲ್ಯವು ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನದಂತೆಯೇ ಇದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.60℃ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಒಲಿಗೋ(dT) ಮತ್ತು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಡಿ.ರಾಂಡಮ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು 60℃ ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೊದಲು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 25℃ ನಲ್ಲಿ ಹಿಡಿದಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳಬೇಕು.ಹೆಚ್ಚಿನ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ತಾಪಮಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ/ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು 65℃ ಡಿನಾಟರಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಹೋಲ್ಡಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ನೇರವಾಗಿ ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಕಾಯಿಸಲ್ಪಟ್ಟ 2× ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು (ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಥರ್ಮಲ್ ಇನಿಶಿಯೇಶನ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಈ ವಿಧಾನವು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಇಂಟರ್ಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಬೇಸ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.PCR ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸುವುದು RT-PCR ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಅನೇಕ ತಾಪಮಾನ ಸ್ವಿಚ್‌ಗಳನ್ನು ಸರಳಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.

Tth ಶಾಖ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಿದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ Mg2+ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು Mn2+ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಇದು 65℃ ವರೆಗೆ ಶಾಖವನ್ನು ಹಿಡಿದಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, PCR ಸಮಯದಲ್ಲಿ Mn2+ ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ನಿಷ್ಠೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು cDNA ಕ್ಲೋನಿಂಗ್‌ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಖರವಾದ ವರ್ಧನೆಗೆ Tth ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿಸುತ್ತದೆ.ಜೊತೆಗೆ, Tth ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಒಂದೇ ಕಿಣ್ವವು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು PCR ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಲ್ಲದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇಲ್ಲದೆ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು cDNA ಯ ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಕಲುಷಿತ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಯಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

4. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಸಂಯೋಜಕ:

ಮೊದಲ ಸರಪಳಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಗ್ಲಿಸರಿನ್ ಮತ್ತು DMSO ಸೇರಿದಂತೆ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳ ಸೇರ್ಪಡೆಯು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RNA ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ಬಿಚ್ಚಬಹುದು.ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ಅಥವಾ MMLV ಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಬಾಧಿಸದೆಯೇ 20% ಗ್ಲಿಸರಿನ್ ಅಥವಾ 10% DMSO ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು.AMV ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡದೆಯೇ 20% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಅನ್ನು ಸಹಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಲ್ಲದು.ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ನಲ್ಲಿ RT-PCR ನ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು, 10% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಅನ್ನು 45℃ ನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಇನ್ಸುಲೇಟ್ ಮಾಡಬಹುದು.ಪಿಸಿಆರ್‌ಗೆ ರೆಟ್ರೊಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್-ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ 1/10 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿದರೆ, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 0.4% ಆಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು ಸಾಕಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

5. RNaseH ಸಂಸ್ಕರಣೆ:

CDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು PCR ಗೆ ಮೊದಲು RNaseH ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡುವ ಮೂಲಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಕೆಲವು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ RNAಯು ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ, ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ದೀರ್ಘವಾದ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಗುರಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ವರ್ಧನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಟ್ಯೂಬರಸ್ ಸ್ಕೆರೋಸಿಸ್Ⅱ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರತಿಯೊಂದಿಗೆ.ಈ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಾಗಿ, ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ಅಥವಾ AMV ಯಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ cDNA ಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಸಂಕೇತವನ್ನು RNaseH ವರ್ಧಿಸಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ RT-PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ, RNaseH ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಐಚ್ಛಿಕವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ 95℃ ಇನ್ಸುಲೇಟೆಡ್ PCR ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಹಂತವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ: ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಕೀರ್ಣದಿಂದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

6. ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್ಎನ್ಎಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸುಧಾರಿತ ವಿಧಾನಗಳು:

ಕೇವಲ ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಲಭ್ಯವಿದ್ದಾಗ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸವಾಲಾಗಿದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕೋಜೆನ್ ಅನ್ನು ವಾಹಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸುವುದು ಸಣ್ಣ ಮಾದರಿಗಳ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.RNase-ಮುಕ್ತ ಗ್ಲೈಕೋಜೆನ್ ಅನ್ನು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ Trizol ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಬಲ್ಲದು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಮಳೆಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡಲು ಆರ್ಎನ್ಎಯೊಂದಿಗೆ ನೀರಿನ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಉಳಿಯಬಹುದು.RNase-ಮುಕ್ತ ಗ್ಲೈಕೋಜೆನ್‌ನ ಶಿಫಾರಸು ಸಾಂದ್ರತೆಯು 50mg ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅಂಗಾಂಶ ಅಥವಾ 106 ಕಲ್ಚರ್ಡ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ 250μg/ml ಆಗಿದೆ.

ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ Ⅱ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಅಸಿಟೈಲೇಟೆಡ್ BSA ಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ RNA ಗಾಗಿ, ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ Ⅱ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RnaseOut ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನ 40 ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಪತ್ತೆ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಸೂಪರ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್Ⅱ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಬಿಎಸ್‌ಎ ಅಥವಾ ಆರ್‌ನೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದನ್ನು ಇನ್ನೂ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

Ⅱ. RT-PCR ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ

1. ಸಿಎನ್ಡಿಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ:

ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ವಿಧಾನದ ಸಂಬಂಧಿತ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.

ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿಧಾನವು ಮೂರು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಚಿಕ್ಕದಾದ, ಭಾಗಶಃ ಉದ್ದದ cDNA ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಹು ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ 5′ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ಗಳು ಮತ್ತು cDNA ಯನ್ನು RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನಾತ್ಮಕ ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದ ಟರ್ಮಿನೇಟಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉದ್ದವಾದ cDNA ಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ಪ್ರತಿ RNA ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನುಪಾತವನ್ನು RNA ಗೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪ್ರತಿ 20μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ 50 ರಿಂದ 250ng ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ರೈಬೋಸೋಮಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಆಗಿರುವುದರಿಂದ, ಪಾಲಿ(ಎ)+ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಒಲಿಗೊ(ಡಿಟಿ) ಆರಂಭವು ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಇದು ಬಹುಪಾಲು ಯೂಕ್ಯಾರಿಯೋಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ mRNAಯ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪಾಲಿ(A) ಬಾಲದೊಂದಿಗೆ ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ ಆಗುತ್ತದೆ.ಪಾಲಿ(ಎ)+ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಸರಿಸುಮಾರು 1% ರಿಂದ 2% ಆಗಿರುವುದರಿಂದ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ.ಅದರ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯಿಂದಾಗಿ, ಒಲಿಗೊ (dT) ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ RNA ಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನುಪಾತ ಮತ್ತು ಪಾಲಿ(A)+ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ.20μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ 0.5μg ಆಲಿಗೋ(dT) ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ RT-PCR ಗೆ oligo(dT)12-18 ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಥರ್ಮೋಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಒಲಿಗೊ(ಡಿಟಿ)20 ಅನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅದರ ಉತ್ತಮ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.

ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (GSP) ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಹಂತಕ್ಕೆ ಉತ್ತಮ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಾಗಿವೆ.GSP ಒಂದು ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಸೈಡ್ ಆಗಿದ್ದು, ಇದು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಒಲಿಗೋ(dT) ನಂತಹ ಎಲ್ಲಾ Rnaಗಳನ್ನು ಅನೆಲ್ ಮಾಡುವುದಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ RNA ಗಮ್ಯಸ್ಥಾನದ ಅನುಕ್ರಮಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ ಮಾಡಬಹುದು.ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸುವ ನಿಯಮಗಳು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ GSP ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕೂ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತವೆ.MRNA3′ ನ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ನಂತೆಯೇ GSP ಯೂ ಆಗಿರಬಹುದು ಅಥವಾ GSP ಯನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕೆಳಕ್ಕೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು.ಕೆಲವು ವರ್ಧಿತ ವಸ್ತುಗಳಿಗೆ, ಯಶಸ್ವಿ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಾಗಿ ಒಂದಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದು ಅಗತ್ಯವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಗುರಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು.20μl ನ ಮೊದಲ ಸರಣಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ 1pmol ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ GSP ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ.

2. ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಶಾಖ ಸಂರಕ್ಷಣೆ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ:

GSP ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಯೋಜನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯೊಂದಿಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು.ಶಾಖ-ಸ್ಥಿರ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿವರ್ತನದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಬೇರ್ಪಡಿಸಬಹುದು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಒಂದು GSP ಯನ್ನು 55°C ನಲ್ಲಿ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಿದರೆ, AMV ಅಥವಾ M-MLV ಬಳಸಿ ಕಡಿಮೆ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಿನೊಂದಿಗೆ 37°C ನಲ್ಲಿ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದರೆ GSP ಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಆದಾಗ್ಯೂ, SuperScripⅡ ಮತ್ತು ThermoScript ಗಳು 50℃ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಬಹುದು, ಇದು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.ಗರಿಷ್ಟ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗಾಗಿ, ಆರ್ಎನ್ಎ/ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ 65℃ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನದಿಂದ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಕಾಯಿಸಲ್ಪಟ್ಟ 2 x ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು (ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಥರ್ಮಲ್ ಇನಿಶಿಯೇಶನ್) ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಅಣುಗಳ ನಡುವೆ ಬೇಸ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಇದು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.PCR ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸುವುದು RT-PCR ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಅನೇಕ ತಾಪಮಾನ ಪರಿವರ್ತನೆಗಳನ್ನು ಸರಳಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.

3. ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ

ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ಒಂದು ಸಂಭಾವ್ಯ ತೊಂದರೆ ಎಂದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಕಲುಷಿತಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಟ್ರೈಝೋಲ್ ರೀಜೆಂಟ್‌ನಂತಹ ಉತ್ತಮ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ವಿಧಾನಗಳ ಬಳಕೆಯು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಿದ್ಧತೆಗಳಲ್ಲಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗೆ ಮೊದಲು ಕಲುಷಿತಗೊಂಡ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಗ್ರೇಡ್ DnasⅠ ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಬಹುದು.DNaseⅠ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 2.0mM EDTA ನಲ್ಲಿ 65℃ ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನು ಅವಲಂಬಿತ ಆರ್ಎನ್ಎ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು EDTA ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ಚೆಲೇಟ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಜೀನೋಮ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನದಿಂದ ವರ್ಧಿತ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು, ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ ಎಕ್ಸಾನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಅನೆಲ್ ಮಾಡುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು.cDNA ಯಿಂದ ಪಡೆದ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಕಲುಷಿತ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ದಿಂದ ಪಡೆದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಗಿಂತ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇಲ್ಲದೆ ನಿಯಂತ್ರಿತ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಸಹ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಕೊಟ್ಟಿರುವ ತುಣುಕು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅಥವಾ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಬಂದಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು.ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪಡೆದ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಜೀನೋಮ್‌ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.

ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನ

ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಸುಲಭ^ᵀᴹನಾನು (ಒಂದು ಹೆಜ್ಜೆ)

-ಒಂದು-ಹಂತದ ಕಿಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು PCR ಅನ್ನು ಒಂದೇ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೈಗೊಳ್ಳಲು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಇದು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ RNA, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ PCR ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು RNase-Free ddH ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ₂O.

-ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ನಿಖರವಾಗಿ ಕೈಗೊಳ್ಳಬಹುದು.

-ಕಿಟ್ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಫೋರ್ಜೀನ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕಾರಕವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಫೋರ್ಜೀನ್ ಹಾಟ್‌ಸ್ಟಾರ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ ಕ್ರಿಯೆಯ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.

ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪತ್ತೆ ಸಂವೇದನೆ, ಬಲವಾದ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.

RT ಈಸಿ II(GDNase ಜೊತೆಗೆ) GDNase ಜೊತೆಗೆ ನೈಜ ಸಮಯದ PCR ಗಾಗಿ ಮೊದಲ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ CDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರೀಮಿಕ್ಸ್

2 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ gDNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದಾದ gDNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಸಮರ್ಥ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ.

-ಸಮರ್ಥ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್, ಇದು ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಯ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು ಕೇವಲ 15 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.

-ಸಂಕೀರ್ಣ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು: ಹೆಚ್ಚಿನ GC ವಿಷಯ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ಹೆಚ್ಚಿನ ದಕ್ಷತೆಯೊಂದಿಗೆ ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದು.

-ಹೈ-ಸೆನ್ಸಿಟಿವಿಟಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್, pg-ಲೆವೆಲ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಸಹ ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ cDNA ಪಡೆಯಬಹುದು.

-ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಸೂಕ್ತ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ತಾಪಮಾನವು 42℃ ಆಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಇದು ಇನ್ನೂ 50℃ ನಲ್ಲಿ ಉತ್ತಮ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.