1. ಮೂಲಭೂತ ಜ್ಞಾನ (ನೀವು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಭಾಗವನ್ನು ನೋಡಲು ಬಯಸಿದರೆ, ದಯವಿಟ್ಟು ನೇರವಾಗಿ ಎರಡನೇ ಭಾಗಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ)

ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿನ ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನದ ಪ್ರಮಾಣದ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ಬದಲಾವಣೆಯ ಮೂಲಕ ನೈಜ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಿಟಿ ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧದ ಮೂಲಕ ಆರಂಭಿಕ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ.

RT-PCR ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಡೇಟಾಬೇಸ್ಲೈನ್, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಿತಿಮತ್ತುCt ಮೌಲ್ಯ.

RT-PCR ಗಾಗಿ ಸಾಮಾನ್ಯ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳು:

2. ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಹಂತಗಳು

2.1 ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿನ ಬಗ್ಗೆ- ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಅನೇಕ ಬಾವಿಗಳು ಇರಬೇಕು ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳು ಇರಬೇಕು.

2.2 ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ತತ್ವಗಳು

①SiRNA ಜಾತಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಜಾತಿಗಳ ಅನುಕ್ರಮವು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

②SiRNA ಅನ್ನು ಫ್ರೀಜ್-ಒಣಗಿದ ಪುಡಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2-4 ವಾರಗಳವರೆಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.

2.3 ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಬೇಕಾದ ಪರಿಕರಗಳು ಅಥವಾ ಕಾರಕಗಳು

2.4 ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕಾದ ಸಮಸ್ಯೆಗಳ ಬಗ್ಗೆ:

①siRNA ವರ್ಗಾವಣೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ

1. ಲೋಹಲೇಪಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು 24-ಬಾವಿ ಪ್ಲೇಟ್, 12-ಬಾವಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಅಥವಾ 6-ವೆಲ್ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು (24-ಬಾವಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾದ ಸರಾಸರಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸುಮಾರು 100-300 ng/uL ಆಗಿದೆ), ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶಗಳ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ವರ್ಗಾವಣೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 60 %-80% ಅಥವಾ ಅದಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ

2. ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಹಂತಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಸೂಚನೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ.

3. ವರ್ಗಾವಣೆಯ ನಂತರ, mRNA ಪತ್ತೆಗಾಗಿ (RT-PCR) ಅಥವಾ 48-96 ಗಂಟೆಗಳ ಒಳಗೆ (WB) ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪತ್ತೆಗಾಗಿ 24-72 ಗಂಟೆಗಳ ಒಳಗೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.

② ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ

1. ಬಾಹ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳಿಂದ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಯಿರಿ.ಇದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮುಖವಾಡಗಳು ಮತ್ತು ಕೈಗವಸುಗಳನ್ನು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಧರಿಸುವುದನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ;ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಪೈಪೆಟ್ ಟಿಪ್ಸ್ ಮತ್ತು ಇಪಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದು;ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಬಳಸಿದ ನೀರು RNase-ಮುಕ್ತವಾಗಿರಬೇಕು.

2. ತ್ವರಿತ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸಿದಂತೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ಮಾಡಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಇದು ನಿಜವಾಗಿಯೂ ಶುದ್ಧತೆ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.

3. ತ್ಯಾಜ್ಯ ದ್ರವವು ಆರ್ಎನ್ಎ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಸ್ಪರ್ಶಿಸಬಾರದು.

③ ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆದ ನಂತರ, ಅದನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ನ್ಯಾನೊಡ್ರಾಪ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ ಓದುವಿಕೆ 10ng/ul ಆಗಿರಬಹುದು.

④ ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ

1. RT-qPCR ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂವೇದನೆಯಿಂದಾಗಿ, ನಂತರದ Ct ತುಂಬಾ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುವುದನ್ನು ತಡೆಯಲು ಅಥವಾ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ SD ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗದಂತೆ ತಡೆಯಲು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 3 ಸಮಾನಾಂತರ ಬಾವಿಗಳನ್ನು ಮಾಡಬೇಕು.

2. ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಡಿ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಪದೇ ಪದೇ ಕರಗಿಸಿ.

3. ಪ್ರತಿ ಟ್ಯೂಬ್/ರಂಧ್ರವನ್ನು ಹೊಸ ತುದಿಯಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಬೇಕು!ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಒಂದೇ ಪೈಪೆಟ್ ತುದಿಯನ್ನು ನಿರಂತರವಾಗಿ ಬಳಸಬೇಡಿ!

4. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ 96-ಬಾವಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಫಿಲ್ಮ್ ಅನ್ನು ಪ್ಲೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸುಗಮಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.ಯಂತ್ರದ ಮೇಲೆ ಹಾಕುವ ಮೊದಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡುವುದು ಉತ್ತಮ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಟ್ಯೂಬ್ ಗೋಡೆಯ ಮೇಲಿನ ದ್ರವವು ಕೆಳಕ್ಕೆ ಹರಿಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಗಾಳಿಯ ಗುಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.

⑤ಸಾಮಾನ್ಯ ಕರ್ವ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ

2.5 ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಬಗ್ಗೆ

qPCR ನ ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಎಂದು ವಿಂಗಡಿಸಬಹುದು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿರುವ ಜೀವಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿರುವ ಜೀವಕೋಶಗಳು,

X ಜೀನ್‌ನ mRNA ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವಾಗಿದೆ;ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, X ಜೀನ್‌ನ mRNA

ಎಷ್ಟು ಪ್ರತಿಗಳಿವೆ, ಇದು ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನಾವು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಬಳಸುವುದು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ,2-ΔΔct ವಿಧಾನಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಇಲ್ಲಿ ವಿವರವಾಗಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಗುವುದು.

2-ΔΔct ವಿಧಾನ: ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶವು ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿರುವ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿನ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಾಗಿದೆ.ಗುರಿಯ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್ ಎರಡರ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಗಳು 100% ಕ್ಕೆ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿರಬೇಕಾದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಪೇಕ್ಷ ವಿಚಲನವು 5% ಮೀರಬಾರದು.

ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ವಿಧಾನವು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ:

Δct ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪು = ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನ ct ಮೌಲ್ಯ - ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿನ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ ct ಮೌಲ್ಯ

Δct ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪು = ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿನ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನ ct ಮೌಲ್ಯ - ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿನ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ ct ಮೌಲ್ಯ

ΔΔct=Δct ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪು-Δct ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪು

ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಬಹುಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿ:

ಪಟ್ಟು=2-ΔΔct ಬದಲಾಯಿಸಿ (ಎಕ್ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಯಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಪವರ್)

ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:

ಸೆಲ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ RT-qPCR ಕಿಟ್