ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತು: ಆರ್ಎನ್ಎ
ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ (ಆರ್‌ಟಿ-ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್) ಎಂಬುದು ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಈ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ, ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಅಥವಾ ಮೆಸೆಂಜರ್ ಆರ್ಎನ್ಎ (ಎಂಆರ್‌ಎನ್‌ಎ) ಅನ್ನು ಮೊದಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮೂಲಕ ಕಾಂಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಡಿಎನ್ಎ (ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ) ಆಗಿ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ತರುವಾಯ, cDNA ಅನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು qPCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.RT-qPCR ಅನ್ನು ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪದ ಮೌಲ್ಯೀಕರಣ, ಮೈಕ್ರೋಅರೇ ಮೌಲ್ಯೀಕರಣ, ರೋಗಕಾರಕ ಪತ್ತೆ, ಆನುವಂಶಿಕ ಪರೀಕ್ಷೆ ಮತ್ತು ರೋಗ ಸಂಶೋಧನೆ ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದ ಅನ್ವಯಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
RT-qPCR ಗಾಗಿ ಒಂದು-ಹಂತ ಮತ್ತು ಎರಡು-ಹಂತದ ವಿಧಾನಗಳು
RT-qPCR ಅನ್ನು ಒಂದು-ಹಂತ ಅಥವಾ ಎರಡು-ಹಂತದ ವಿಧಾನದಿಂದ ಸಾಧಿಸಬಹುದು.ಒಂದು ಹಂತದ RT-qPCR ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು PCR ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅದೇ ಬಫರ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಒಂದು-ಹಂತದ RT-qPCR ಗೆ ಅನುಕ್ರಮ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಬಳಕೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಎರಡು-ಹಂತದ RT-qPCR ನಲ್ಲಿ, ವಿಭಿನ್ನ ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಬಫರ್‌ಗಳು, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎರಡು ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
| ಅನುಕೂಲ | ಅನನುಕೂಲತೆ | |
| ಒಂದು ಹೆಜ್ಜೆ | ಈ ವಿಧಾನವು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ದೋಷವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಎರಡೂ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ
ಕಡಿಮೆ ಪೈಪ್ಟಿಂಗ್ ಹಂತಗಳು ಮಾಲಿನ್ಯದ ಅಪಾಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ
ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ ವರ್ಧನೆ/ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್, ವೇಗದ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ | ಎರಡು-ಹಂತದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ
ಎರಡು-ಹಂತದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ರಾಜಿಯಾಗುವುದರಿಂದ, ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು ಎರಡು-ಹಂತದ ವಿಧಾನದಂತೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿಲ್ಲ
ಒಂದೇ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ ಗುರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ |
| ಎರಡು ಹಂತಗಳು | ದೀರ್ಘಕಾಲ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದಾದ ಮತ್ತು ಬಹು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಬಹುದಾದ ಸ್ಥಿರವಾದ cDNA ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ರಚಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ
ಬಹು cDNA ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲದೇ ಒಂದೇ cDNA ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಜೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಬಹುದು
ಏಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ರನ್‌ಗಳ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಬಫರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು
ಪ್ರಚೋದಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಆಯ್ಕೆ | ಬಹು ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪೈಪೆಟಿಂಗ್ ಹಂತಗಳು DNA ಮಾಲಿನ್ಯದ ಅಪಾಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಸಮಯ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.
ಒಂದು-ಹಂತದ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ |
ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:
RT-qPCR ಸುಲಭ (ಒಂದು ಹಂತ)-SYBR ಹಸಿರು I
RT-qPCR ಸುಲಭ (ಒಂದು ಹಂತ)-ತಕ್ಮನ್
RT ಸುಲಭ I ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರೀಮಿಕ್ಸ್ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ CDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ
ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ PCR Easyᴹ-SYBR ಗ್ರೀನ್ ಐ ಕಿಟ್
ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸುಲಭ-ತಕ್ಮನ್
ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಮತ್ತು ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಆಯ್ಕೆ
RT-qPCR ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವಾಗ, ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಅಥವಾ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಅನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಬಳಸಬೇಕೆ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂವೇದನೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಬಹುದಾದರೂ, ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಇನ್ನೂ ಆಗಾಗ್ಗೆ ಬಳಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ಕಾರಣವೆಂದರೆ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎಗಿಂತ ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರಯೋಜನವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕಡಿಮೆ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಹಂತಗಳು ಬೇಕಾಗುತ್ತವೆ, ಇದು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಉತ್ತಮ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಚೇತರಿಕೆ ಮತ್ತು ಸೆಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಗಳನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಉತ್ತಮ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ಖಾತ್ರಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, ಇದು mRNA ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಹಂತವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ವಿಭಿನ್ನ mRNA ಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಚೇತರಿಕೆಗಳಿಂದಾಗಿ ಓರೆಯಾದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಬಹುದು.ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳಲ್ಲಿ ಗುರಿಯ ವಂಶವಾಹಿಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣವು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ಸಂಪೂರ್ಣ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್
ಎರಡು-ಹಂತದ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ, cDNA ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅವಿಭಾಜ್ಯಗೊಳಿಸಲು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು: ಒಲಿಗೊ(dT) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಅನುಕ್ರಮ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು.ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ, ಒಲಿಗೊ(dT) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ mRNA ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದೊಂದಿಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ.
| ಪ್ರೈಮರ್ ಆಯ್ಕೆ | ರಚನೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯ | ಅನುಕೂಲ | ಅನನುಕೂಲತೆ |
| ಒಲಿಗೊ(ಡಿಟಿ) ಪ್ರೈಮರ್ (ಅಥವಾ ಆಂಕರ್ಡ್ ಆಲಿಗೊ(ಡಿಟಿ) ಪ್ರೈಮರ್) | mRNAಯ ಪಾಲಿ(A) ಬಾಲದಲ್ಲಿ ಥೈಮಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ವಿಸ್ತೃತ ಅನೆಲಿಂಗ್;ಆಂಕರ್ ಒಲಿಗೊ(dT) ಪ್ರೈಮರ್ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ (ಆಂಕರ್ ಸೈಟ್) G, C, ಅಥವಾ A ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ | ಪಾಲಿ(A)-ಟೈಲ್ಡ್ mRNA ಯಿಂದ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ cDNA ಯ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ
ಕಡಿಮೆ ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತು ಲಭ್ಯವಿದ್ದಾಗ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ
ಎಂಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ 5′ ಪಾಲಿ(ಎ) ಬಾಲಕ್ಕೆ ಆಲಿಗೋ(ಡಿಟಿ) ಪ್ರೈಮರ್ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಆಂಕರ್ ಮಾಡುವ ಸೈಟ್ ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ. | ಪಾಲಿ(A) ಬಾಲಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಮಾತ್ರ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ
ಪಾಲಿ(A) ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ ಸೈಟ್*2 ನಿಂದ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ cDNA ಪಡೆಯಿರಿ
3′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಲು ಪಕ್ಷಪಾತಿ*
*ಆಂಕರ್ಡ್ ಆಲಿಗೋ(ಡಿಟಿ) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ |
| ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್
| 6 ರಿಂದ 9 ಬೇಸ್‌ಗಳ ಉದ್ದ, ಇದು ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಬಹು ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಬಹುದು | ಎಲ್ಲಾ ಆರ್ಎನ್ಎಗಳಿಗೆ ಅನೆಲ್ (tRNA, rRNA, ಮತ್ತು mRNA)
ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತು ಲಭ್ಯವಿರುವಾಗ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ
ಹೆಚ್ಚಿನ cDNA ಇಳುವರಿ | cDNA ಎಲ್ಲಾ RNAಯಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಲಿಪ್ಯಂತರವಾಗಿದೆ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಯಸುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಗುರಿ mRNA ಯ ಸಂಕೇತವನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬಹುದು
ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ CDNA ಪಡೆಯಿರಿ |
| ಅನುಕ್ರಮ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು | ನಿರ್ದಿಷ್ಟ mRNA ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಕಸ್ಟಮ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು | ನಿರ್ದಿಷ್ಟ cDNA ಲೈಬ್ರರಿ
ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಿ
ರಿವರ್ಸ್ qPCR ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದು | ಒಂದೇ ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಮಾತ್ರ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ |
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಒಂದು ಕಿಣ್ವವಾಗಿದ್ದು ಅದು ಡಿಎನ್ಎ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಕೆಲವು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಳು RNase ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ನಂತರ RNA-DNA ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ RNA ಎಳೆಗಳನ್ನು ಕೆಡಿಸಬಹುದು.ಇದು RNase ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ qPCR ದಕ್ಷತೆಗಾಗಿ RNaseH ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳಲ್ಲಿ ಮೊಲೊನಿ ಮುರಿನ್ ಲ್ಯುಕೇಮಿಯಾ ವೈರಸ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಏವಿಯನ್ ಮೈಲೋಬ್ಲಾಸ್ಟೊಮಾ ವೈರಸ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಸೇರಿವೆ.RT-qPCR ಗಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಥರ್ಮೋಸ್ಟೆಬಿಲಿಟಿ ಹೊಂದಿರುವ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವುದು ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು, ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಧ್ಯಮಿಕ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳ ಯಶಸ್ವಿ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಖಾತ್ರಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಅವುಗಳ ಸಂಪೂರ್ಣ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ cDNA ಇಳುವರಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.
ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:
ಫೋರೆಸಿ M-MLV ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ನ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆ
RNaseH ಆರ್ಎನ್ಎ-ಡಿಎನ್ಎ ಡ್ಯುಪ್ಲೆಕ್ಸ್‌ಗಳಿಂದ ಆರ್ಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಕೆಡಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಸಮರ್ಥ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ದೀರ್ಘವಾದ mRNA ಯನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಬಳಸುವಾಗ, RNA ಅಕಾಲಿಕವಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ cDNA ಮೊಟಕುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ದೀರ್ಘ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಬಯಸಿದಲ್ಲಿ cDNA ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ RNaseH ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು ಪ್ರಯೋಜನಕಾರಿಯಾಗಿದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಳು qPCR ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನೇಕವೇಳೆ ಪ್ರಯೋಜನಕಾರಿಯಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವು PCR ನ ಮೊದಲ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ RNA-DNA ಡ್ಯುಪ್ಲೆಕ್ಸ್‌ಗಳ ಕರಗುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ
RT-qPCR ನಲ್ಲಿ qPCR ಹಂತಕ್ಕೆ ಬಳಸಲಾಗುವ PCR ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ ಎಕ್ಸಾನ್-ಎಕ್ಸಾನ್ ಜಂಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕು, ಅಲ್ಲಿ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪ್ರೈಮರ್ ನಿಜವಾದ ಎಕ್ಸಾನ್-ಇಂಟ್ರಾನ್ ಗಡಿಯನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸಬಹುದು.ಇಂಟ್ರಾನ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸದೆ ಇರುವುದರಿಂದ, ಈ ವಿನ್ಯಾಸವು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಕಲುಷಿತಗೊಳಿಸುವುದರಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕ ಅಪಾಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಎಕ್ಸಾನ್-ಎಕ್ಸಾನ್ ಗಡಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗದಿದ್ದರೆ, ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಸೆ-ಮುಕ್ತ DNase I ಅಥವಾ dsDNase ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡುವುದು ಅಗತ್ಯವಾಗಬಹುದು.
RT-qPCR ನಿಯಂತ್ರಣ
DNA ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಎಲ್ಲಾ RT-qPCR ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು (-RT ನಿಯಂತ್ರಣ) ಸೇರಿಸಬೇಕು (ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಹಿಂದಿನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಅಥವಾ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳು).ಈ ನಿಯಂತ್ರಣವು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಈ ನಿಯಂತ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವು ಸಂಭವಿಸುವುದಿಲ್ಲವಾದ್ದರಿಂದ, PCR ವರ್ಧನೆಯು ಗಮನಿಸಿದರೆ, DNA ನಿಂದ ಮಾಲಿನ್ಯವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ.
ಪೋಸ್ಟ್ ಸಮಯ: ಆಗಸ್ಟ್-02-2022
