• ಪಿಸಿಆರ್ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಡಿಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಿಂದ ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧಿಸಲು ಬಳಸುವ ಒಂದು ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮೂಲದಿಂದ ಡಿಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಅದನ್ನು ವರ್ಧಿಸಬಹುದು.
• PCR ಮತ್ತು RT-PCR ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ ಅಂತ್ಯಬಿಂದು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು, ಆದರೆ qPCR ಮತ್ತು RT-qPCR ಪ್ರಸ್ತುತ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪನ್ನದ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ದರದ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ.
• ಡಿಜಿಟಲ್ ಪಿಸಿಆರ್‌ನಂತಹ ಹೊಸ ವಿಧಾನಗಳು ಆರಂಭಿಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಐಸೋಥರ್ಮಲ್ ಪಿಸಿಆರ್‌ನಂತಹ ವಿಧಾನಗಳು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ದುಬಾರಿ ಉಪಕರಣಗಳ ಅಗತ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ (PCR) ಡಿಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಮತ್ತು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸರಳ ಮತ್ತು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದ ತಂತ್ರವಾಗಿದೆ.DNA ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ದಿನಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬಹುದು, PCR ಗೆ ಕೆಲವೇ ಗಂಟೆಗಳ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಮತ್ತು ವರ್ಧಿಸಲು ಕನಿಷ್ಠ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಮೂಲಭೂತ PCR ವಿಧಾನಗಳು ಸರಳವಾದ DNA ಮತ್ತು RNA ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯಿಂದ ಮತ್ತಷ್ಟು ಮುಂದುವರೆದಿದೆ.ಕೆಳಗೆ, ನಾವು ವಿವಿಧ PCR ವಿಧಾನಗಳ ಅವಲೋಕನವನ್ನು ಒದಗಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ನಿಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನಾ ಅಗತ್ಯಗಳಿಗಾಗಿ ನಾವು Enzo Life Sciences ನಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸುವ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಿದ್ದೇವೆ.ವಿಜ್ಞಾನಿಗಳು ತಮ್ಮ ಮುಂದಿನ ಸಂಶೋಧನಾ ಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲು PCR ಕಾರಕಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುವ ಗುರಿಯನ್ನು ನಾವು ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ!

ಪಿಸಿಆರ್

ಪ್ರಮಾಣಿತ PCR ಗಾಗಿ, ನಿಮಗೆ ಬೇಕಾಗಿರುವುದು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್, ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳು, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ವರ್ಧಿಸಬೇಕಾದ ಡಿಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮತ್ತು ಥರ್ಮೋಸೈಕ್ಲರ್.ಪಿಸಿಆರ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಅದರ ಉದ್ದೇಶದಂತೆ ಸರಳವಾಗಿದೆ: 1) ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ (ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎ) ಹೀಟ್ ಡಿನೇಚರ್ಡ್ ಆಗಿದೆ, 2) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಸಿಂಗಲ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಜೋಡಿಸುತ್ತವೆ, ಮತ್ತು 3) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನಿಂದ ವಿಸ್ತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಎರಡು ಪ್ರತಿಗಳು ಮೂಲ DNA ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್.ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಮಯಗಳ ಸರಣಿಯ ಮೇಲೆ ಡಿನಾಟರೇಶನ್, ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಉದ್ದನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ವರ್ಧನೆಯ ಒಂದು ಚಕ್ರ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1).

ಸೈಕಲ್‌ನ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಹಂತವನ್ನು ಬಳಸಿದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಸೆಟ್‌ಗೆ ಹೊಂದುವಂತೆ ಮಾಡಬೇಕು.ಈ ಚಕ್ರವು ಸರಿಸುಮಾರು 20-40 ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ನಂತರ ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ (Fig. 2) ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಬಹುದು.

ಪಿಸಿಆರ್ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ವಿಧಾನವಾಗಿರುವುದರಿಂದ ಮತ್ತು ಒಂದೇ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಬಹಳ ಸಣ್ಣ ಸಂಪುಟಗಳು ಬೇಕಾಗುವುದರಿಂದ, ಹಲವಾರು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಬೇಕು ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಿಂದ ವಿಭಜಿಸಬೇಕು, ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಅದೇ ಪ್ರಮಾಣದ ಕಿಣ್ವ, dNTP ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.ಎಂಜೊ ಲೈಫ್ ಸೈನ್ಸಸ್‌ನಂತಹ ಅನೇಕ ಪೂರೈಕೆದಾರರು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಈಗಾಗಲೇ ಎಲ್ಲವನ್ನೂ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಶ್ರಣಗಳನ್ನು ಸಹ ನೀಡುತ್ತಾರೆ.

ಗ್ವಾನೈನ್/ಸೈಟೋಸಿನ್-ಸಮೃದ್ಧ (ಜಿಸಿ-ಸಮೃದ್ಧ) ಪ್ರದೇಶಗಳು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಪಿಸಿಆರ್ ತಂತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಸವಾಲನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.ಕಡಿಮೆ GC ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗಿಂತ GC-ಭರಿತ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಇದಲ್ಲದೆ, ಜಿಸಿ-ಸಮೃದ್ಧ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ಲೂಪ್‌ಗಳಂತಹ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಜಿಸಿ-ಸಮೃದ್ಧ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಹೊಸ ಎಳೆಯನ್ನು ಅಡೆತಡೆಯಿಲ್ಲದೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನವು ಇದನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಸಮಯದ ಕಡೆಗೆ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳು ಜಿಸಿ-ರಿಚ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು.ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಕಾರಕಗಳು ಜಿಸಿ-ರಿಚ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ಗಳ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು.DMSO, ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಮತ್ತು ಬೀಟೈನ್ GC ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆ ಮೂಲಕ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಸುಲಭಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.

ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್

ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆಯು PCR ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಬಹುದಾದ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ.ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಳು ಸುಮಾರು 68°C ನಿಂದ 72°C ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕಿಣ್ವವು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿರಬಹುದು, ಆದರೂ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಿದ್ದರೂ ಸಹ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರ ಮಾತ್ರ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇದನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು, ಆದ್ದರಿಂದ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಎಂಬ ಪದ.ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರತಿಕಾಯವಾಗಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ಆರಂಭಿಕ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 95 ° C).

ಹೈ ಫಿಡೆಲಿಟಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್

DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಳು ಮೂಲ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ತಕ್ಕಮಟ್ಟಿಗೆ ನಿಖರವಾಗಿ ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಲ್ಲಿ ತಪ್ಪುಗಳು ಸಂಭವಿಸಬಹುದು.ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಯಂತಹ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗದಿರುವುದು ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಿಗೆ ಮತ್ತು ತಪ್ಪಾಗಿ ಭಾಷಾಂತರಿಸಿದ ಅಥವಾ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಈ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು, "ಪ್ರೂಫ್ ರೀಡಿಂಗ್" ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೆಲಸದ ಹರಿವಿನಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮೊದಲ ಪ್ರೂಫ್ ರೀಡಿಂಗ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್, Pfu, 1991 ರಲ್ಲಿ ಪೈರೊಕೊಕಸ್ ಫ್ಯೂರಿಯೊಸಸ್ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿತು.ಈ Pfu ಕಿಣ್ವವು 3' ರಿಂದ 5' ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟಂತೆ, ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ 3' ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.ಸರಿಯಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅನ್ನು ನಂತರ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಮುಂದುವರಿಯುತ್ತದೆ.ತಪ್ಪಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯು ಕಿಣ್ವದೊಂದಿಗೆ ಸರಿಯಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಅಲ್ಲಿ ಅಸಮರ್ಥ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಿಧಾನಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸರಿಯಾದ ಬದಲಿಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.Pfu ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಪ್ರೂಫ್ ರೀಡಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಅಂತಿಮ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ದೋಷಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ.ಇತ್ತೀಚಿನ ವರ್ಷಗಳಲ್ಲಿ, ಇತರ ಪ್ರೂಫ್ ರೀಡಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ದೋಷದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಇನ್ನಷ್ಟು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮೂಲ Pfu ಕಿಣ್ವದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

RT-PCR

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ PCR, ಅಥವಾ RT-PCR, RNA ಅನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಹಂತವು RNA ಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಮತ್ತು ವರ್ಧಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಾಂಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಡಿಎನ್ಎ (ಸಿಡಿಎನ್ಎ) ಆಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಆಗಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯು ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಯಶಸ್ಸಿಗೆ ಅತ್ಯಗತ್ಯ.RT-PCR ನ ಮೊದಲ ಹಂತವೆಂದರೆ DNA/RNA ಹೈಬ್ರಿಡ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ RNase H ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸಹ ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಹೈಬ್ರಿಡ್‌ನ RNA ಭಾಗವನ್ನು ಕುಗ್ಗಿಸುತ್ತದೆ.ಏಕ-ತಂತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಅಣುವು ನಂತರ ಡಿಎನ್‌ಎ-ಅವಲಂಬಿತ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿ ಪೂರ್ಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು.ಇಲ್ಲಿಂದ, cDNA ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಪ್ರಮಾಣಿತ PCR ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ನಿಂದ ಹಿಂತಿರುಗಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯು ಅನೇಕ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಇದನ್ನು ಪ್ರಾಥಮಿಕವಾಗಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಏಕ-ತಂತು ಮತ್ತು ಅತ್ಯಂತ ಅಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು ಕೆಲಸ ಮಾಡಲು ಸವಾಲಾಗುವಂತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ qPCR ನಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಹಂತವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಜೈವಿಕ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ RNA ನಕಲುಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.

qPCR ಮತ್ತು RT-qPCR

ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ PCR (qPCR) ಅನ್ನು ಹಲವಾರು ಅನ್ವಯಗಳಿಗೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು, ನಿರೂಪಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.RT-qPCR ನಲ್ಲಿ, RNA ನಕಲುಗಳನ್ನು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೊದಲು cDNA ಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ qPCR ಅನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಮಾಣಿತ ಪಿಸಿಆರ್‌ನಲ್ಲಿರುವಂತೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಮೂರು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಹಂತಗಳಿಂದ ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ: ಡಿನಾಟರೇಶನ್, ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಉದ್ದನೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, qPCR ನಲ್ಲಿ, ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಮುಂದುವರೆದಂತೆ ಡೇಟಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಲಭ್ಯವಿರುವ ವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಿಂದಾಗಿ ಈ ತಂತ್ರವು ಅನೇಕ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.

ಡೈ-ಆಧಾರಿತ qPCR (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹಸಿರು), ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಒಂದು dsDNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೈ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವರ್ಧಿತ DNA ಅಣುಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು "ನೈಜ-ಸಮಯ"ದಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3).ಡೈ-ಆಧಾರಿತ qPCR ಗೆ ಅನನುಕೂಲವೆಂದರೆ ಒಂದು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಒಂದು ಗುರಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿರುವ ಯಾವುದೇ ds-DNA ಗೆ ಬಣ್ಣವು ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.

ಪ್ರೋಬ್-ಆಧಾರಿತ qPCR ನಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಅನೇಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು, ಆದರೆ ಇದಕ್ಕೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಜೊತೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗುವ ಗುರಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತನಿಖೆ(ಗಳ) ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಮತ್ತು ವಿನ್ಯಾಸದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಹಲವಾರು ವಿಧದ ಪ್ರೋಬ್ ವಿನ್ಯಾಸಗಳು ಲಭ್ಯವಿವೆ, ಆದರೆ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿಧವೆಂದರೆ ಹೈಡ್ರೊಲಿಸಿಸ್ ಪ್ರೋಬ್, ಇದು ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಮತ್ತು ಕ್ವೆಂಚರ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ.ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಎನರ್ಜಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರ್ (FRET) ತನಿಖೆಯು ಹಾಗೇ ಇರುವಾಗ ಕ್ವೆಂಚರ್ ಮೂಲಕ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್‌ನ ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿಸ್ತರಣೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮದ ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತನಿಖೆಯನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ತನಿಖೆಯ ಸೀಳುವಿಕೆಯು ಕ್ವೆಂಚರ್‌ನಿಂದ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕದಲ್ಲಿ ವರ್ಧನೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4).ಹೀಗಾಗಿ, ಪ್ರೋಬ್-ಆಧಾರಿತ qPCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಬ್ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮದ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಬ್-ಆಧಾರಿತ qPCR ಡೈ-ಆಧಾರಿತ qPCR ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ qPCR-ಆಧಾರಿತ ರೋಗನಿರ್ಣಯ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವಾಗಿದೆ.

ಐಸೊಥರ್ಮಲ್ ವರ್ಧನೆ

ಮೇಲೆ ತಿಳಿಸಿದ ಪಿಸಿಆರ್ ತಂತ್ರಗಳಿಗೆ ಡಿನಾಟರೇಶನ್, ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣಾ ಹಂತಗಳಿಗಾಗಿ ಚೇಂಬರ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ರಾಂಪ್ ಮಾಡಲು ದುಬಾರಿ ಥರ್ಮೋಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಉಪಕರಣದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಅಂತಹ ನಿಖರವಾದ ಸಾಧನಗಳ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲದ ಹಲವಾರು ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸರಳವಾದ ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಆಸಕ್ತಿಯ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ಈ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟಾಗಿ ಐಸೊಥರ್ಮಲ್ ವರ್ಧನೆ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಘಾತೀಯ, ರೇಖೀಯ ಅಥವಾ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್ ವರ್ಧನೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.

ಐಸೊಥರ್ಮಲ್ ವರ್ಧನೆಯ ಅತ್ಯಂತ ಪ್ರಸಿದ್ಧ ವಿಧವೆಂದರೆ ಲೂಪ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಐಸೊಥರ್ಮಲ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್, ಅಥವಾ LAMP.ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ DNA ಅಥವಾ RNA ಯನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು LAMP 65⁰C ನಲ್ಲಿ ಘಾತೀಯ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.LAMP ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವಾಗ, ಹೊಸ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಪ್ರದೇಶಗಳಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ನಾಲ್ಕರಿಂದ ಆರು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇವುಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು ಅದು ಇತರ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ DNA ಯಲ್ಲಿ "ಲೂಪ್" ರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ, ಅದು ನಂತರದ ಸುತ್ತುಗಳ ವರ್ಧನೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನೆಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್, ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅಥವಾ ಕಲರ್ಮೆಟ್ರಿ ಸೇರಿದಂತೆ ಅನೇಕ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಲ್ಯಾಂಪ್ ಅನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಬಹುದು.ವರ್ಣಮಾಪನದಿಂದ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸುವ ಮತ್ತು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸುಲಭ ಮತ್ತು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ದುಬಾರಿ ಸಲಕರಣೆಗಳ ಕೊರತೆಯು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಲ್ಯಾಬ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯು ಸುಲಭವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿಲ್ಲದ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ LAMP ಅನ್ನು SARS-CoV-2 ಪರೀಕ್ಷೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನಾಗಿ ಮಾಡಿದೆ, ಅಥವಾ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು ಸಾಗಣೆ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾಗಿರಲಿಲ್ಲ, ಅಥವಾ ಹಿಂದೆ PCR ಥರ್ಮೋಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಉಪಕರಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಲ್ಯಾಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ.