RT-qPCR ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದ ಮೂಲ ಪ್ರಯೋಗವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬರೂ ಅದರೊಂದಿಗೆ ಪರಿಚಿತರಾಗಿರಬೇಕು.ಇದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮೂರು ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್.ಇದು ಸಹಾಯ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ, ಏನು ನಡೆಯುತ್ತಿದೆ?ಇದರಲ್ಲಿ ಸಮಸ್ಯೆ ಇರುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಇದೆಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪ್ರಯೋಗ!ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರಯೋಗವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಡಿಎನ್‌ಟಿಪಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆಯಾದರೂರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್ಗೆ ಮತ್ತು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ, ಆದರೆ ನಿಜವಾದ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ಇನ್ನೂ ಅನೇಕ ವಿವರಗಳಿಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು.ಅದರ ಬಗ್ಗೆ ಕಲಿಯೋಣ!

ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿರ್ಣಯಿಸುವುದು?
ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಪಡೆಯಲು, ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ!ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಎರಡು ಅಂಶಗಳಿಂದ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು:
(1) ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆ:ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು. ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟ್‌ಗಳನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಸಂಪೂರ್ಣ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮೂರು ಸ್ಪಷ್ಟ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ದೊಡ್ಡದರಿಂದ ಚಿಕ್ಕದಕ್ಕೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕವು 28S, 18S ಮತ್ತು 5S ಆಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 28S 18S ಗಿಂತ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾಗಿರುತ್ತದೆ;ಮೂರು ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ನೋಡಬಹುದಾದರೆ, ಆದರೆ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಪ್ರಕಾರವು ಮಸುಕಾಗಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ಡಿಫ್ಯೂಷನ್ ಎಂದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಭಾಗಶಃ ಕ್ಷೀಣಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ದಯವಿಟ್ಟು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ನಿರ್ವಹಿಸಿ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಅನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ;ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕ ಅಥವಾ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಇಲ್ಲದಿರುವ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ನೋಡಬಹುದಾದರೆ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಮರು-ಹೊರತೆಗೆಯಬೇಕಾಗಿದೆ.ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಗರಿಷ್ಠ ರೇಖಾಚಿತ್ರ ಮತ್ತು RIN ಮೌಲ್ಯದೊಂದಿಗೆ RNA ಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ಹಾಗೇ ಇದ್ದರೆ, ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೆರೋಗ್ರಾಮ್ನ ಬೇಸ್ಲೈನ್ ​​ಸಮತಟ್ಟಾಗಿರುತ್ತದೆ;ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ತೀವ್ರವಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಿಸಿದರೆ, ಬೇಸ್ಲೈನ್ ​​ಅಸಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಅವನತಿ ಶಿಖರಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ;RIN ನ ಮೌಲ್ಯವು RNA ಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ, 0-10 ರ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ, ದೊಡ್ಡ ಮೌಲ್ಯವು RNA ಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಸರಿ, ಸಂಪೂರ್ಣತೆಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟ.
(2) ಆರ್ಎನ್ಎ ಶುದ್ಧತೆ:OD260/280 ಅನುಪಾತವನ್ನು UV ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು.OD260/280 ಅನುಪಾತವು 1.9 ಮತ್ತು 2.1 ರ ನಡುವೆ ಇದ್ದರೆ, ಶುದ್ಧತೆ ತುಂಬಾ ಒಳ್ಳೆಯದು.
ಉಳಿದಿರುವ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯು ನಿಖರವಾದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು
ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯುವಾಗ, ನಾವು ಪಡೆಯುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ (ಜಿಡಿಎನ್‌ಎ) ಯೊಂದಿಗೆ ಮಿಶ್ರಣವಾಗಬಹುದು.ಆದ್ದರಿಂದ, ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ನಂತರ cDNA ಅನ್ನು ಸಹ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆgDNA.ಡೌನ್ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿqPCRಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ,cDNAಮತ್ತು gDNA ಅನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಬಹುದು, ಇದು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಣ್ಣ CT ಮೌಲ್ಯಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಪಕ್ಷಪಾತವಾಗಿರಬಹುದು.
ಹಾಗಾದರೆ ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಏನು ಮಾಡಬೇಕು?ಪೂರ್ವಜನ್ಯಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ:
(1) ರಿವರ್ಸ್ಡ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಮೇಲೆ ಜಿನೋಮ್ ಕ್ಲೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಾಲಮ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದು;
(2) ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNAಯನ್ನು DNase ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿI , ಆದರೆ ಅದನ್ನು EDTA ಯೊಂದಿಗೆ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಿ;
ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಕಾರಕಗಳಜೀನೋಮ್ ಕ್ಲಿಯರಿಂಗ್ ಮಾಡ್ಯೂಲ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ;

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಹೇಗೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವುದು?
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ನ ಫಲಿತಾಂಶದ ಮೇಲೆ ಸಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ.ಪ್ರಯೋಗದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಂದರ್ಭಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ನೀವು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ ಅಥವಾ ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು:
(1) ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಗಳುಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ;
(2) ಉದ್ದವಾದ ತುಣುಕು ಪ್ರತಿಗಳು: ಒಲಿಗೋ ಡಿಟಿ/ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ;
(3) ದೀರ್ಘ-ವಿಭಾಗದ ಪ್ರತಿಗಳ ಆಂತರಿಕ ತುಣುಕುಗಳು: ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು/ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು/ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು + ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ.ನಂತರದ qPCR ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಡೆಸಿದರೆ, Oligo dT ಅನ್ನು ಏಕಾಂಗಿಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ Oligo dT ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ 3′ ಅಂತಿಮ ಪಕ್ಷಪಾತಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ಇದು ತಪ್ಪಾದ qPCR ಪ್ರಯೋಗ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ;
(4) miRNA: ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಟೈಲಿಂಗ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.

ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಉತ್ಪನ್ನ cDNA ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬೇಕು?
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ cDNA ಅನ್ನು ಪಡೆದ ನಂತರ, qPCR ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ cDNA ಅನ್ನು ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬೇಕು ಎಂಬುದು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ.cDNA ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು.cDNA ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಬಹುದೇ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಹೇಗೆ ಮಾಡಬೇಕು?
(1) ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ cDNA ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ cDNA ಉತ್ಪನ್ನದ ಜೊತೆಗೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಉತ್ಪನ್ನವು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರೆಸಿಶುಯಲ್ ಬಫರ್, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಇತ್ಯಾದಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಏಕಾಗ್ರತೆಯ ಮಾಪನ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು OD/280260/280260 ನಿಜವಾದ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕೆಲವು ಸ್ನೇಹಿತರು ಹೇಳುತ್ತಾರೆ, ನಂತರ ನಾನು ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ನಂತರ ಏಕಾಗ್ರತೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತೇನೆ;cDNA ಅನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ಇಲ್ಲಿ Foregene ನೆನಪಿಸಲು ಬಯಸುತ್ತಾರೆ, ಏಕೆಂದರೆ ರಿವರ್ಸಲ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ cDNA ಯ ಉದ್ದವು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣದಲ್ಲಿ ಚಿಕ್ಕ cDNA ಕಳೆದುಹೋಗುತ್ತದೆ.
(2) ಹಾಗಾದರೆ ಏನು ಮಾಡಬೇಕು?qPCR ಪ್ರಯೋಗದ ಮೊದಲು, cDNA ಯ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಪ್ರಯೋಗದ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಬಹುದು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ: cDNA ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರ, 10-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು 100-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು qPCR ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸಿ ಮತ್ತು 18-28 ರ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ CT ಮೌಲ್ಯದೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.

ಮೈಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಹೇಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಮಾಡಬೇಕು?
miRNA ಎಂಬುದು ಸುಮಾರು 22 nt ಗಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಏಕ-ತಂತಿಯ ಸಣ್ಣ ಅಣು RNA ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಕೋಡ್ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.ಅದರ ಕಡಿಮೆ ಉದ್ದದ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ, ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ qPCR ವಿಧಾನವು ಅದನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ miRNA ಯನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಲು ಇದು ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ;miRNA ಗಾಗಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ವಿಧಾನಗಳು ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನ ಮತ್ತು ಟೈಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ.
ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮೈಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುವುದು ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಈ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಪತ್ತೆ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಒಂದು ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವು ಒಂದು miRNA ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ;ಬಾಲ-ಸೇರಿಸುವ ವಿಧಾನವು ಎರಡರಿಂದ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ಎರಡು ಕಿಣ್ವಗಳ ಜಂಟಿ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಪೂರ್ಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಅವು ಪಾಲಿಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್.ಪಾಲಿಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ತನ್ನ ಉದ್ದವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಮೈಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ ಪಾಲಿಎ ಬಾಲಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ವಿಧಾನವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪತ್ತೆ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಒಂದು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಹು ಮೈಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳು ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಸ್ಟೆಮ್-ಲೂಪ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.