ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬರೂ qRT-PCR ಪ್ರಯೋಗದ ತತ್ವ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ, ಫಲಿತಾಂಶದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ, ಇತ್ಯಾದಿಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಮಾತನಾಡುತ್ತಿದ್ದಾರೆ, ಆದರೆ qRT-PCR ನ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯನ್ನು ನಾನು ನಿಮ್ಮೊಂದಿಗೆ ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳಬೇಕೆಂದು ನಾನು ಭಾವಿಸುತ್ತೇನೆ.ಇದು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಬಗ್ಗೆ.

qRT-PCR ಮಾಡುವ ಮೊದಲು, ನಾವು ನಮ್ಮ ಸ್ವಂತ RNA ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ವಿಧಾನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು.ಎಲ್ಲಾ ನಂತರ, ನಮ್ಮ ಪ್ರಯತ್ನಗಳು ಸರಳವಾಗಿ ಅಭ್ಯಾಸ ಮಾಡುವ ಬದಲು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುವ ಗುರಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ qRT-PCR ಮಾಡುವ ಮೊದಲು, ನಾವು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕು (ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು SYBR ಗೆ ಮಾತ್ರ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತವೆ).

1 ನಿಮ್ಮ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕ್ಷೀಣವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ನೀವು ಖಚಿತವಾಗಿ ಬಯಸುವಿರಾ?

ನ್ಯಾನೊಡ್ರಾಪ್ 2000 ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಇಂಟೆಸಿಟಿ ಸಂಖ್ಯೆ) ಮೌಲ್ಯವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಅಂಜೂರ. ವಿವಿಧ RNA ಮಾದರಿಗಳಿಗಾಗಿ RIN ಮೌಲ್ಯಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (ಯೂಕ್ಯಾರಿಯೋಟ್‌ಗಳು)

ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ.ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ ಜೆಲ್ ಮೂಲಕ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು, ಆದರೆ ಆರ್ಎನ್ಎ ಒಟ್ಟು ಮೊತ್ತದ ಅವಶ್ಯಕತೆ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸಾಮಾನ್ಯ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ವೇಗವಾದ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತ ವಾತಾವರಣದಲ್ಲಿ ಇರಬೇಕಾದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಟ್ಯಾಂಕ್, ಸೋಲ್ ಬಾಟಲ್, ಜೆಲ್ ಬ್ರಾಕೆಟ್ ಮತ್ತು ಬಾಚಣಿಗೆಯನ್ನು ಡಿಇಪಿಸಿ ನೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆಯುವುದು ಅವಶ್ಯಕ.ಅಗರೋಸ್ ಕೂಡ ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಅದು ಹೊಸದಾಗಿ ತೆರೆದಿರುವವರೆಗೆ), ಮತ್ತು ಲೋಡಿಂಗ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು 1.2% ಜೆಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ಹೊಸದಾಗಿ ತೆರೆಯಬೇಕು.

ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿನ ಮಾದರಿ 9 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಜೆಲ್ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕರಗಬೇಕು, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಅದು ಏಕರೂಪದ ಬ್ಯಾಂಡ್ಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಿ.ವೋಲ್ಟೇಜ್ ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚು ಕಾಲ ಚಾಲನೆಯಲ್ಲಿರುವಾಗ ಶಾಖವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರ್ಎನ್ಎ ಅವನತಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಮತ್ತು ಸಮಯವನ್ನು ಸಮಂಜಸವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು.ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, ಜೆಲ್ ರನ್ನಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ಶೇಷವಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ವಿತರಿಸುವ ಬಾವಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿರುವ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳಿವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬಹುದು.

ಚಿತ್ರ.ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಪತ್ತೆ

2 ನಿಮ್ಮ cDNA ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಬಗ್ಗೆ ನಿಮಗೆ ಖಚಿತವಾಗಿದೆಯೇ?

ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದಲ್ಲಿ ದೊಡ್ಡ ಸಹೋದರರ ಅನುಭವವೆಂದರೆ ಪ್ರತಿ ವಿಲೋಮದಿಂದ ಪಡೆದ 20 ul ಸಿಸ್ಟಮ್ನ cDNA ನೇರವಾಗಿ 20X ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ನಂತರದ ಡಾಕ್ಟರೇಟ್ ಸಹೋದರಿಯರು 10X ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಾನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತೇನೆ.ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬ ವ್ಯಕ್ತಿಯು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಿರುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಹಿಮ್ಮುಖದ ಮಟ್ಟವೂ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸಲ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ.

ಹಾಗಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಬಾರಿ ನಾನು ರಿವರ್ಸ್ಡ್ cDNA ಅನ್ನು ಪಡೆದಾಗ, ನಾನು ಅದನ್ನು ಮೊದಲು ಸುಮಾರು 3 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುತ್ತೇನೆ ಮತ್ತು ನಂತರ RT-PCR ಮಾಡಲು ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇನೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 25 ಚಕ್ರಗಳು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಅಂತಿಮ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.

3 ನಿಮ್ಮ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಸುಲಭವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನೀವು ಖಚಿತವಾಗಿ ಬಯಸುವಿರಾ?

ಇದು qRT-PCR ನ ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಹಾದುಹೋಗಬಹುದು, ಆದರೆ ಇದು ಇನ್ನೂ ಹಣವನ್ನು ಖರ್ಚು ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚು ಹಣವಿಲ್ಲದ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳಿಗೆ, ಅವರು ಸಾಕಷ್ಟು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆದಾಗ, ಅವರು ಸಾಮಾನ್ಯ RT-PCR ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಅದು ಒಂದೇ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಆಗಿದೆಯೇ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು.ಪ್ರಯೋಗಾಲಯವು ಹಣದ ಕೊರತೆಯಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಮೂಲಕ ಒಮ್ಮೆ ಗುರುತಿಸಬಹುದು.

4 ನಿಮ್ಮ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಸೂಕ್ತವಾಗಿವೆ ಎಂದು ನೀವು ಖಚಿತವಾಗಿ ಬಯಸುವಿರಾ?

SYBR ಅನ್ನು ಬಲವಾದ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ರಕ್ಷಿಸಬೇಕು, ಆದ್ದರಿಂದ SYBR ಕಾರಕವನ್ನು ಸೇರಿಸುವಾಗ ಓವರ್ಹೆಡ್ ಲೈಟ್ ಅನ್ನು ಆಫ್ ಮಾಡಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು ಮಂದ ಬೆಳಕನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.

SYBR ಅನ್ನು 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.ಬಳಕೆಯಲ್ಲಿದ್ದಾಗ, ಫೋಮಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಮೇಲಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಳಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿಸಿ ಮತ್ತು ಬಲವಾಗಿ ಸುಳಿಯಬೇಡಿ.

ಕೆಲವು ಕಿರಿಯ ಸಹೋದರಿಯರು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡುವ ಭಯದಿಂದ PCR ಬೋರ್ಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಸೆಳೆಯಲು ಇಷ್ಟಪಡುತ್ತಾರೆ, ಅದು ತಪ್ಪು.ನಿಮ್ಮ ಗುರುತುಗಳು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತಗಳ ಸಂಗ್ರಹದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿರುವುದರಿಂದ, ಕೆಳಗೆ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಮೆಮೊರಿಯಲ್ಲಿ ಸಹಾಯ ಮಾಡಲು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ನೋಟ್‌ಬುಕ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಿರಿಯರಿಗೆ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.

ಚಿತ್ರ.qRT-PCR ಮಾದರಿ ಲೋಡಿಂಗ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ

5 ನೀವು ಅದನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದೀರಿ ಎಂದು ನಿಮಗೆ ಖಚಿತವಾಗಿದೆಯೇ?

ಕೈಗವಸುಗಳನ್ನು ಧರಿಸಲು, ಕೈಗವಸುಗಳನ್ನು ಧರಿಸಲು, ಕೈಗವಸುಗಳನ್ನು ಧರಿಸಲು ಮತ್ತು ಮೂರು ಬಾರಿ ಪ್ರಮುಖ ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಹೇಳಲು ಮರೆಯದಿರಿ.

SYBR ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಳ್ಳುವುದನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು, ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ನಾನು ವೈಯಕ್ತಿಕವಾಗಿ ಮೊದಲು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಬಯಸುತ್ತೇನೆ.ಅನುಭವದ ಪ್ರಕಾರ, ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು ಮಾದರಿ ದೋಷಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ದೋಷವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು, ನಾನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮತ್ತೆ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುತ್ತೇನೆ ಮತ್ತು H2O2 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವಾಗ ಮೊತ್ತವನ್ನು ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುತ್ತೇನೆ.

ಚಿತ್ರ.qRT-PCR ಲೋಡಿಂಗ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ

ನಂತರ qRT-PCR ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಕಾನ್ಫಿಗರ್ ಮಾಡಿ.

ಚಿತ್ರ.qRT-PCR ಸಿಸ್ಟಮ್ ತಯಾರಿ ರೇಖಾಚಿತ್ರ

ಸೂಚನೆ: ಸಂರಚನಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾಡಬೇಕಾಗಿದೆ.

ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ, ಪಾರದರ್ಶಕ ಸೀಲಿಂಗ್ ಫಿಲ್ಮ್ ಅನ್ನು ಅಂಟಿಸಿ.ನಿಮ್ಮ ಕೈಗಳಿಂದ ಪಾರದರ್ಶಕ ಸೀಲಿಂಗ್ ಫಿಲ್ಮ್ನ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ಸ್ಪರ್ಶಿಸದಿರಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ, ಚಿತ್ರದ ಎರಡೂ ಬದಿಗಳಲ್ಲಿ ಜಾಗದಿಂದ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಿ.ಏಕೆಂದರೆ ಫಿಂಗರ್‌ಪ್ರಿಂಟ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತಗಳ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಮೇಲೂ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು.ನಂತರ ಗೋಡೆಯ ಮೇಲೆ ನೇತಾಡುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಕಡಿಮೆ ವೇಗದಲ್ಲಿ 10 ಸೆಕೆಂಡುಗಳವರೆಗೆ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಬಳಸಿ.

ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:

ಸೆಲ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ RT-qPCR ಕಿಟ್

RT ಸುಲಭ II