ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ

ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ಉದ್ದೇಶವು PCR ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸುವುದು.ಅನೇಕ ಅಸ್ಥಿರಗಳ ಹೆಚ್ಚು ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಊಹಿಸಬಹುದಾದ ಪ್ರಭಾವದಿಂದ ಇದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿರುವ ಅನುಕ್ರಮವು ಒಂದು ಪ್ರಮುಖ ವೇರಿಯಬಲ್ ಆಗಿದೆ.

ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ PCR ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳು ವ್ಯಾಪಕ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಇದರಿಂದಾಗಿ PCR ಕಾರಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಪರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಮುಖ್ಯ ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.

ಸಹಜವಾಗಿ, ಕೆಲವು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ಅತ್ಯಂತ ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ನಿಕಟವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಆದರೆ ವಿಭಿನ್ನ ರೋಗಕಾರಕಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುವುದು ಗುರಿಯಾಗಿರುವಾಗ, ವಿಶೇಷ ವಿನ್ಯಾಸ, ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಮತ್ತು ಪರಿಶೀಲನಾ ಮಾನದಂಡಗಳ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.

ಕರಗುವ ವಕ್ರರೇಖೆಯು ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಒಂದು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ, ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ಗುರಿಯನ್ನು ವರ್ಧಿಸಬೇಕೆ ಎಂಬ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕರಗುವ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ತಪ್ಪುದಾರಿಗೆಳೆಯುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ ಎಂದು ಒತ್ತಿಹೇಳಬೇಕು ಏಕೆಂದರೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸಬ್‌ಪ್ಟಿಮಲ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಸಂಯೋಜಿತ ಪರಿಣಾಮಗಳಿಂದ ಅವು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು.

P5 |ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಎರಡು ಗುರಿ ಡಿಎನ್‌ಎಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಮಾಣದ ಎರಡು ಪತ್ತೆಗಳಿಂದ ಪಡೆದ Tm ಶಿಫ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.

A. ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (ಜಾಹೀರಾತು), qPCR ಮಾಪನ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಇರುವುದಿಲ್ಲ.ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 50 ಪ್ರತಿಗಳಿಗೆ (ಇ) ಕಡಿಮೆಯಾದಂತೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಉತ್ಪನ್ನವು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ (ಎಫ್) ಏಕೈಕ ಉತ್ಪನ್ನವಾಗುತ್ತದೆ.

ಬಿ. ಪರೀಕ್ಷೆಯು ಎಲ್ಲಾ ಗುರಿ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಟಿಎಂಎಸ್ ಅನ್ನು ದಾಖಲಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲೂ (5 ಪ್ರತಿಗಳು) ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಇರಲಿಲ್ಲ.ಈ ಎರಡು ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, NTC ಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ.

ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಇರುವ ಮಾದರಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಪಡೆದ ವಿಸರ್ಜನೆಯ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು P5 ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.P 5a ಎರಡು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ, ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ Tms ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.

ನಿಸ್ಸಂಶಯವಾಗಿ, ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಈ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಎನ್‌ಟಿಸಿಗಳು, ಅಂದರೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಇಲ್ಲದ ಮಾದರಿಗಳು, (ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ) ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿಲ್ಲ, ಇದು ಹಿನ್ನೆಲೆ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ/ಪಾಲಿಮರೀಕರಣದಲ್ಲಿ ಭಾಗವಹಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಅಂತಹ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ನಿವಾರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಯಾವುದೇ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು NTC (P 5b) ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ಆಗಾಗ್ಗೆ ಸಾಧ್ಯವಿದೆ.

ಇಲ್ಲಿ, 35 ರ Cq ನೊಂದಿಗೆ ಗುರಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡುವುದು ಸಹ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಸರ್ಜನೆಯ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ.ಅಂತೆಯೇ, NTC ಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯ ಯಾವುದೇ ಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ.ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ, ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ನಡವಳಿಕೆಯು ತಾಯಿಯ ಮದ್ಯದ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬಫರ್ ಸಂಯೋಜನೆಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ಪತ್ತೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ವಿಭಿನ್ನ Mg2+ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು.

ಪತ್ತೆ ಸ್ಥಿರತೆ

Ta ದ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ qPCR ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮತ್ತು ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಉಪಯುಕ್ತ ಹಂತವಾಗಿದೆ.ಇದು NTC ಯನ್ನು ವರ್ಧಿಸದೆಯೇ ಕಡಿಮೆ Cq ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ತಾಪಮಾನವನ್ನು (ಅಥವಾ ತಾಪಮಾನ ಶ್ರೇಣಿ) ತೋರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೈಮರ್ ಸೆಟ್‌ನ ದೃಢತೆಯ ನೇರ ಸೂಚನೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.

ಹೆಚ್ಚಿನ mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಹೊಂದಿರುವ ಜನರಿಗೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯ ಎರಡರಿಂದ ನಾಲ್ಕು ಪಟ್ಟು ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ, ಇದು ಧನಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ತಪ್ಪು ಋಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಅರ್ಥೈಸಬಹುದು.

qPCR ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ Ta ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಬಹಳವಾಗಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು.ಕೆಲವು ಪರೀಕ್ಷೆಗಳು ಹೆಚ್ಚು ದೃಢವಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅತ್ಯುತ್ತಮ Ta ಮೌಲ್ಯದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸದಿದ್ದರೆ, ಅವು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಕುಸಿಯುತ್ತವೆ.

ಇದು ಮುಖ್ಯವಾದುದು ಏಕೆಂದರೆ ಈ ರೀತಿಯ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆ ನೈಜ ಜಗತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾದರಿಯ ಶುದ್ಧತೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆ ಅಥವಾ ಇತರ ಡಿಎನ್‌ಎಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಸೂಕ್ತವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ.

ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಗುರಿಯ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯು ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಕಾರಕಗಳು, ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಪಾತ್ರೆಗಳು ಅಥವಾ ಉಪಕರಣಗಳು ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವಾಗ ಬಳಸುವುದಕ್ಕಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು.

P6|ತಾಪಮಾನದ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಪತ್ತೆಯ ವಿಭಿನ್ನ ದೃಢತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.

ಎ. ಮಾನವನ ಮೆದುಳಿನ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಲಾದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಪಿಸಿಆರ್ ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಬಯೋಲಿನ್‌ನ ಸೆನ್ಸಿಫಾಸ್ಟ್ ಎಸ್‌ವೈಬಿಆರ್ ಮಾಸ್ಟರ್‌ಮಿಕ್ಸ್ (ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ BIO-98050) ಬಳಸಿ.

B. ಅಪಾಲೀನ್‌ನ ವರ್ಧನೆ ನಕ್ಷೆ ಮತ್ತು ವಿಸರ್ಜನೆಯ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲು Bio-Rad ನ CFX qPCR ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) ನ ವರ್ಧನೆಯ ಗ್ರಾಫ್ ಮತ್ತು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್.

D. GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCTCCTCCTCGTGGATCTTC) ಯ ವರ್ಧನೆಯ ಗ್ರಾಫ್ ಮತ್ತು ವಿಸರ್ಜನೆಯ ಕರ್ವ್.

E. Cqs ವಿವಿಧ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಗಳಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ, 7C ತಾಪಮಾನ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾದ Cq ನಲ್ಲಿ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.

P 6 ಅನಪೇಕ್ಷಿತ ಪರೀಕ್ಷೆಯ ವಿಶಿಷ್ಟ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ qPCR ಅನ್ನು 59C ಮತ್ತು 67C (P 6a) ನಡುವಿನ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ Tas ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೂರು ಮಾನವ ಮೆದುಳಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.

ಓಪಲಿನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಆದರ್ಶದಿಂದ ದೂರವಿದೆ ಎಂದು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಗ್ರಾಫ್‌ನಿಂದ ನೋಡಬಹುದಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳ ಸೂಕ್ತ Ta ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ಬಹಳ ಕಿರಿದಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 6b), ಅಂದರೆ, Cqಗಳು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಹರಡಿರುತ್ತವೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ Cqs ಅವುಗಳ ಅತ್ಯುತ್ತಮ Cqs ಕಡಿಮೆಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೋಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಈ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವು ಅಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಬ್‌ಪ್ಟಿಮಲ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಮರುವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕು.ಜೊತೆಗೆ, ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಇನ್‌ಸೆಟ್) ಈ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕವಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರತಿ Ta ದ ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

P 6c ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ACSBG1 ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವು ಮೇಲಿನ ಓಪಾಲಿನ್ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ದೃಢವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಇನ್ನೂ ಆದರ್ಶದಿಂದ ದೂರವಿದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.

ಆದಾಗ್ಯೂ, ದೃಢತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ನಡುವೆ ಯಾವುದೇ ಅಗತ್ಯ ಸಂಪರ್ಕವಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತೇವೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನದಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ವಿಸರ್ಜನೆಯ ರೇಖೆಯು ಎಲ್ಲಾ ಟಾಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ಇನ್‌ಸೆಟ್) ಒಂದೇ ಗರಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.

ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ದೃಢತೆ ಪರೀಕ್ಷೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, P 6d ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ GFAP ಪರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ Tas ನಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ Cq ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ.

ಅದೇ 8 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್ ಶ್ರೇಣಿಯಲ್ಲಿ ಪಡೆದ Cqs ನಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು 1 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವಿಸರ್ಜನೆಯ ಕರ್ವ್ (ಇನ್ಸೆಟ್) ಈ ತಾಪಮಾನದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ Tas ಮತ್ತು ನಿಜವಾದ Ta ಶ್ರೇಣಿಯು ತುಂಬಾ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಅಂಶವಾಗಿದೆ.

ದಕ್ಷ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ಸಂಶೋಧಕರಿಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಹಲವು ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿವೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವು ದೀರ್ಘಕಾಲ ಸ್ಥಾಪಿತವಾದ ನಿಯಮಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ 3′ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗಮನವನ್ನು ನೀಡಲಾಗಿದೆ.3' ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ G ಅಥವಾ C ಮತ್ತು ಎರಡು G ಅಥವಾ C ಬೇಸ್‌ಗಳನ್ನು (GC ಕ್ಲಾಂಪ್) ಸೇರಿಸಲು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಕೊನೆಯ 5 ಬೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ.

ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ, ಈ ನಿಯಮಗಳು ಸಂಶೋಧಕರಿಗೆ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನ ನೀಡಬಹುದು, ಆದರೆ ಎಲ್ಲಾ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಅವು ಸರಿಯಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ.

P7 |ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ಅಂತ್ಯವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಅಥವಾ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.

A. ಮಾನವ HIF-1α (NM_181054.2) ಜೀನ್‌ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನ.

B. ಆರು ಪರೀಕ್ಷಾ ಐಟಂಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ III SYBR ಹಸಿರು ತಾಯಿಯ ಮದ್ಯವನ್ನು (ಕ್ಯಾಟ್. ನಂ. 600882) ಬಳಸಿ.

C. ಬಯೋ-ರಾಡ್‌ನ CFX qPCR ಉಪಕರಣ ಮತ್ತು 3′end ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಂದ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಗ್ರಾಫ್ ಮತ್ತು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್.NTC ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.

ಪ್ರತಿ ಪರೀಕ್ಷಾ ಐಟಂನ D. Cqs ದಾಖಲೆ

ಉದಾಹರಣೆಗೆ, P 7 ರಲ್ಲಿನ ಫಲಿತಾಂಶವು 3′ಅಂತ್ಯ ನಿಯಮಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ವಿನ್ಯಾಸಗಳು ಮೂಲತಃ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತವೆ, ಕೇವಲ ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್ ಸಂಯೋಜನೆಗಳು NTC ಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ.

ಆದಾಗ್ಯೂ, GC ಕ್ಲಿಪ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಾವು ಬೆಂಬಲಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, A ಅಥವಾ T ಅನ್ನು ಗರಿಷ್ಠ 30 ಬೇಸ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸುವುದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.

GGCC ಯಲ್ಲಿ F ಪ್ರೈಮರ್ ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುವ ಟೆಸ್ಟ್ C, NTC ಗಳಲ್ಲಿ Cqs ಅನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿದೆ, 30-ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿ ಈ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಬಯಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿಯ ಅತ್ಯುತ್ತಮ 3′ಅಂತ್ಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಏಕೈಕ ಮಾರ್ಗವೆಂದರೆ ಕೆಲವು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವುದು ಎಂದು ನಾವು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತೇವೆ.

ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ

ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ PCR ಪತ್ತೆಯು ಎಂದಿಗೂ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗದಿದ್ದರೂ, ಕಿಣ್ವ, ತಾಯಿಯ ಮದ್ಯ, ಸೇರ್ಪಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ವಿವಿಧ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಬಹುದು.

ಪಿಸಿಆರ್ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ಗುರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ 10 ಅಥವಾ 5 ಪಟ್ಟು ಸರಣಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಉತ್ತಮ, ಅಂದರೆ, "ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ವಿಧಾನ".

ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಬಳಸಿದರೆ, ಈ ಗುರಿಗಳ ಸರಣಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರ ಪ್ರಮಾಣದ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಡಿಎನ್‌ಎ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ) ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಬೇಕು.

P8 |ಪಿಸಿಆರ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಡೈಲ್ಯೂಷನ್ ಕರ್ವ್.

A. HIF-1 ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ಮತ್ತು R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ಮತ್ತು ಎಜಿಲೆಂಟ್‌ನ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ III SYBR ಗ್ರೀನ್ ಮಾಸ್ಟರ್‌ಮಿಕ್ಸ್ (ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 600882) PCR ಮತ್ತು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗಾಗಿ.

B. 100 ng ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹಿಮ್ಮುಖವಾಗಿ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 2 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸರಣಿಯಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾದ cDNA ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 1 ng ಮಾನವ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಗೆ 5 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಇನ್ಸೆಟ್ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.

C. ಎರಡನೇ cDNA ಮಾದರಿಗಾಗಿ RT ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ, ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಸರಣಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಹೋಲುತ್ತವೆ.

P 8 ಎರಡು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ cDNA ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಫಲಿತಾಂಶವು ಒಂದೇ ದಕ್ಷತೆಯಾಗಿದೆ, ಸುಮಾರು 100%, ಮತ್ತು R2 ಮೌಲ್ಯವು ಸಹ ಹೋಲುತ್ತದೆ, ಅಂದರೆ, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾ ಮತ್ತು ರಿಗ್ರೆಷನ್ ಲೈನ್ ಅಥವಾ ಡೇಟಾ ರೇಖಾತ್ಮಕತೆಯ ಪದವಿ ನಡುವಿನ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಮಟ್ಟ.

ಎರಡು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಹೋಲಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ನಿಖರವಾಗಿ ಒಂದೇ ಅಲ್ಲ.ಗುರಿಯನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುವುದು ಉದ್ದೇಶವಾಗಿದ್ದರೆ, ಅನಿಶ್ಚಿತತೆಯನ್ನು ವಿವರಿಸದೆ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುವುದು ಸ್ವೀಕಾರಾರ್ಹವಲ್ಲ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು.

P9 |ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಮಾಪನ ಅನಿಶ್ಚಿತತೆ.

A. PCR ಮತ್ತು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು GAPDH (NM_002046) ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ಮತ್ತು R: TAACTGGTTGAGCACAGG ಮತ್ತು ಬಯೋಲೈನ್‌ನ ಸೆನ್ಸಿಫಾಸ್ಟ್ SYBR ಮಾಸ್ಟರ್‌ಮಿಕ್ಸ್ (ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ BIO-98050).

B. ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಚಾರ್ಟ್, ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಮತ್ತು ಬಯೋ-ರಾಡ್‌ನ CFX qPCR ಉಪಕರಣದೊಂದಿಗೆ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್.

C. ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ಗ್ರಾಫ್ ಮತ್ತು 95% ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರ (CI).

ಡಿ. ಡಿಲ್ಯೂಷನ್ ಕರ್ವ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ ಮೂರು Cq ಮೌಲ್ಯಗಳ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು 95% ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರ.

P 9 ಒಂದು ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಪರೀಕ್ಷೆಗಾಗಿ, ಒಂದೇ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯ ಅಂತರ್ಗತ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ಸರಿಸುಮಾರು 2 ಬಾರಿ (95% ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರ, ಕನಿಷ್ಠದಿಂದ ಗರಿಷ್ಠ) ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಬಹುದಾದ ಚಿಕ್ಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಾಗಿರಬಹುದು.

ಸಂಬಂಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನ:

ಸೆಲ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ RT qPCR ಕಿಟ್

ಮೌಸ್ ಟೈಲ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್

ಅನಿಮಲ್ ಟಿಶ್ಯೂ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್