ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಆಧಾರ (99% ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಬಹುದು)

1. ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದ: ಪಠ್ಯಪುಸ್ತಕಕ್ಕೆ 15-30bp ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸುಮಾರು 20bp.ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ನಿಜವಾದ ಸ್ಥಿತಿಯು 18-24bp ಆಗಿರುವುದು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಮುಂದೆ ಉತ್ತಮವಾದ, ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾದ ಪ್ರೈಮರ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

2. ಪ್ರೈಮರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಸ್ಪ್ಯಾನ್: 200-500bp ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ತುಣುಕನ್ನು 10kb ಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು.

3. ಪ್ರೈಮರ್ ಬೇಸ್: G+C ಯ ವಿಷಯವು 40-60% ಆಗಿರಬೇಕು, ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ G+C ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಪರಿಣಾಮವು ಉತ್ತಮವಾಗಿಲ್ಲ, ಹೆಚ್ಚು G+C ಅಲ್ಲದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಸುಲಭ.5 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ಯೂರಿನ್ ಅಥವಾ ಪಿರಿಮಿಡಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಸಮೂಹಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುವ ಮೂಲಕ ATGC ಅನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.5′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಮಲ್ಟಿ-ಜಿಸಿ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಮಧ್ಯಂತರ ಅನುಕ್ರಮಗಳು, 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಶ್ರೀಮಂತ ಜಿಸಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ, ಕೊನೆಯ 3 ಬೇಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಜಿಸಿ ಇಲ್ಲ ಅಥವಾ ಕೊನೆಯ 5 ಬೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 3 ಜಿಸಿ ಇಲ್ಲ.

4. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸೆಕೆಂಡರಿ ರಚನೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ ಮತ್ತು ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಪೂರಕತೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ 3 'ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿ ಪೂರಕತೆ, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ರಚನೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧಿತ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

5. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ 3 'ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿರುವ ಬೇಸ್‌ಗಳು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕೊನೆಯ ಮತ್ತು ಅಂತಿಮ ನೆಲೆಗಳು, ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಬೇಸ್‌ಗಳಿಂದ PCR ವೈಫಲ್ಯವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಜೋಡಿಸಬೇಕು.

6. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಸೂಕ್ತವಾದ ಸೀಳನ್ನು ಹೊಂದಬಹುದು ಅಥವಾ ಸೇರಿಸಬಹುದು, ಮತ್ತು ವರ್ಧಿತ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮವು ಸೂಕ್ತವಾದ ಸೀಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು, ಇದು ಸೀಳು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅಥವಾ ಆಣ್ವಿಕ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್‌ಗೆ ಬಹಳ ಪ್ರಯೋಜನಕಾರಿಯಾಗಿದೆ.

7. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ: ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಇತರ ಅನುಕ್ರಮಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಾರದು.

8. ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಕಲಿಯಿರಿ: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ಈ ಆನ್‌ಲೈನ್ ವಿನ್ಯಾಸವು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ).

ಮೇಲಿನ ವಿಷಯವು ಕನಿಷ್ಠ 99% ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸುತ್ತದೆ.

ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ವಿವರಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಿ

1. ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದ

ಸಾಮಾನ್ಯ ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವು 18~30 ಬೇಸ್ ಆಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶವೆಂದರೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಉದ್ದ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (Tm ಮೌಲ್ಯ -5℃), ಮತ್ತು ಕೆಲವರು ನೇರವಾಗಿ Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಾರೆ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸ್ಥೂಲವಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಕೆಳಗಿನ ಸೂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.

ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಉದ್ದವು 20bp ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇದ್ದಾಗ: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಉದ್ದವು 20bp ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/ಉದ್ದ-5℃

ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಅನೇಕ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಬಹುದು, ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ತತ್ವವು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಮೌಲ್ಯವು ಸಣ್ಣ ಅಂತರವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು.PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿಸಲು, 54℃ ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಖಾತ್ರಿಪಡಿಸುವ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ನಾಲ್ಕು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನ್ವಯಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವು 18 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದದ ಮೇಲಿನ ಮಿತಿಯು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ದಕ್ಷತೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ.ಎಂಟ್ರೊಪಿಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವಾದಷ್ಟೂ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಸ್ಥಿರವಾದ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಗುರಿಯ ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ದರವು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.

ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಉದ್ದವನ್ನು ಪ್ರತಿಯಾಗಿ TM ಮೌಲ್ಯದಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ನ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗೆ, TM=60℃ ಅಥವಾ ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು.

2.ಜಿಸಿ ವಿಷಯ

ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ G+C ಯ ವಿಷಯವು 40%~60% ಆಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು GC ವಿಷಯ ಮತ್ತು Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಒಂದು ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಬೇಕು.ಪ್ರೈಮರ್ ಗಂಭೀರ GC ಅಥವಾ AT ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 5 'ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣದ A, T ಅಥವಾ G ಮತ್ತು C ಟೈಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು.

3. ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ

ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ಚೈನ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕಿಂತ 5℃ ಕಡಿಮೆ ಇರಬೇಕು.ಪ್ರೈಮರ್ ಬೇಸ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಬೇಸ್ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ದೊಡ್ಡದಾಗಿದ್ದರೆ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು.4℃ ~ 6℃ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಜೋಡಿ ನಡುವಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು PCR ಇಳುವರಿ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ ಒಂದು ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದು 55℃ ~ 75℃ ನಡುವೆ ಬದಲಾಗಬಹುದು.

4. ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ

ವರ್ಧಿತ ತುಣುಕನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವಾಗ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುವುದು ಉತ್ತಮ.ಗುರಿಯ ತುಣುಕಿನ ಸ್ಥಿರ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ಸಂಬಂಧಿತ ಕಂಪ್ಯೂಟರ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನಿಂದ ಊಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಅಂದಾಜು ಮಾಡಬಹುದು, ಇದು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಸಹಾಯಕವಾಗಿದೆ.ವಿಸ್ತರಿಸಬೇಕಾದ ಪ್ರದೇಶದ ಮುಕ್ತ ಶಕ್ತಿ (△G) 58.6lkJ/mol ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇದ್ದಾಗ ವಿಸ್ತರಣೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವಿಫಲವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.

5. ಗುರಿಯ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ

ವರ್ಧಿತ ಗುರಿಯ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮವು ದೊಡ್ಡದಾದಾಗ, ಪ್ರೈಮರ್ ಗುರಿಯ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಬಹು ಭಾಗಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಬಹುದು, ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬಹು ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಫಲಿತಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ.ಈ ಬಾರಿ BLAST ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪರೀಕ್ಷೆ, ವೆಬ್‌ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.ಎರಡು ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿಸಿ (bl2seq) ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.

ವಲಯ 1 ಕ್ಕೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಅಂಟಿಸುವುದು ಮತ್ತು ವಲಯ 2 ಕ್ಕೆ ಗುರಿಪಡಿಸುವ DNA ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಬದಲಾಯಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ, ಮತ್ತು BLAST ಪೂರಕ, ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಸಾಧ್ಯತೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಬಳಕೆದಾರರು ಎರಡೂ ಸರಪಳಿಗಳು ಅರ್ಥ ಸರಪಳಿಗಳು ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕಾಗಿಲ್ಲ.ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಅನುಕ್ರಮದ GI ಸಂಖ್ಯೆ ನಿಮಗೆ ತಿಳಿದಿದ್ದರೆ ನೀವು GI ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಸಹ ನಮೂದಿಸಬಹುದು, ಆದ್ದರಿಂದ ನೀವು ಅನುಕ್ರಮದ ದೊಡ್ಡ ವಿಭಾಗವನ್ನು ಅಂಟಿಸಬೇಕಾಗಿಲ್ಲ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಗುರಿ ಡಿಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಬಹು ಹೋಮೋಲಾಜಸ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡಲು 3 ನಲ್ಲಿ ಅಲೈನ್ ಅನ್ನು ಕ್ಲಿಕ್ ಮಾಡಿ.

6. ಪ್ರೈಮರ್ ಟರ್ಮಿನಲ್

ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3 'ಅಂತ್ಯವು ವಿಸ್ತರಣೆಯು ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅಲ್ಲಿ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗದಂತೆ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ತಡೆಯುವುದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.3 'ಅಂತ್ಯವು 3 ಸತತ G ಅಥವಾ C ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರಬಾರದು, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು G+C ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅನುಕ್ರಮ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ತಪ್ಪಾಗಿ ಪ್ರಚೋದಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.3 'ಅಂತ್ಯವು ಯಾವುದೇ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ವಿಶೇಷ PCR (AS-PCR) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಅಂತ್ಯವು ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ವರ್ಧಿಸಿದರೆ, ಕೋಡಾನ್‌ನ ಮೂರನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3 'ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಬಾರದು, ಏಕೆಂದರೆ ಕೋಡಾನ್‌ನ ಮೂರನೇ ಸ್ಥಾನವು ಅವನತಿಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ವರ್ಧನೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಅನುಬಂಧ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, ಕೋಡಾನ್ ಬಳಕೆಯ ಕೋಷ್ಟಕವನ್ನು ನೋಡಿ, ಜೈವಿಕ ಆದ್ಯತೆಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಿ, 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಬಂಧ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಡಿ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ (1uM-3uM).

7. ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆ

ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಸ್ವತಃ ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಾರದು, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಸ್ವತಃ ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ಮಡಚಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಈ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಸ್ಟೆರಿಕ್ ಅಡಚಣೆಯಿಂದಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್‌ಗಳ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಕೃತಕ ತೀರ್ಪು ಬಳಸಿದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಿರಂತರ ಪೂರಕ ನೆಲೆಗಳು 3bp ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರಬಾರದು.ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಯಾವುದೇ ಪೂರಕತೆ ಇರಬಾರದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು 3 'ಎಂಡ್‌ನ ಪೂರಕ ಅತಿಕ್ರಮಣವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಬೇಕು.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಒಂದು ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವೆ 4 ಅನುಕ್ರಮ ಬೇಸ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಹೋಮಾಲಜಿ ಅಥವಾ ಪೂರಕತೆ ಇರಬಾರದು.

8. ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಲೊಕಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿ

5 'ಅಂತ್ಯವು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ವರ್ಧನೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರದಂತೆ ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು.ಪ್ರೈಮರ್ 5 'ಎಂಡ್‌ನ ಮಾರ್ಪಾಡು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು: ಕಿಣ್ವ ನಿರ್ಬಂಧದ ತಾಣವನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು;ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಬಯೋಟಿನ್, ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್, ಡಿಗೋಕ್ಸಿನ್, Eu3+, ಇತ್ಯಾದಿ. ಪ್ರೋಟೀನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿ;ರೂಪಾಂತರದ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸುವುದು, ರೂಪಾಂತರ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು ಮತ್ತು ಕಾಣೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರವರ್ತಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸುವುದು ಇತ್ಯಾದಿ. ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನೆಲೆಗಳು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚು ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ರಚನೆಯ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಮುಂದಿನ ಹಂತಕ್ಕೆ ಕೆಲವು ರಿಯಾಯಿತಿಗಳನ್ನು ಮಾಡಬೇಕು.ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರವರ್ತಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳಂತಹ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿಲ್ಲದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರದಂತೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 5′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಬಹುದು.ಈ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪ್ರೈಮರ್ Tm ಮೌಲ್ಯಗಳ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಪೂರಕತೆ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕು.

9. ಸಬ್ಕ್ಲೋನ್ಸ್

ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮಯ, ಪಿಸಿಆರ್ ಕೇವಲ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಆಗಿದೆ, ಮತ್ತು ನಂತರ ನಾವು ಗುರಿಯ ತುಣುಕನ್ನು ವಿವಿಧ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳಾಗಿ ಸಬ್‌ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ನಾವು ಪಿಸಿಆರ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಮುಂದಿನ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಬೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.

ಸಬ್‌ಕ್ಲೋನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಕೆಲವು ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಕೆಳಗೆ ಸಂಕ್ಷೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ.
ನಿರ್ಬಂಧದ ಎಂಡೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ನಿರ್ಬಂಧದ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ

ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಸಬ್‌ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡಲು ಕಿಣ್ವ ನಿರ್ಬಂಧದ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಸೀಳು ತಾಣವು ಆರು ಬೇಸ್‌ಗಳಾಗಿದ್ದು, ಸೀಳು ಸೈಟ್‌ನ 5 'ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ 2 ~ 3 ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ನೆಲೆಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ವಿವಿಧ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ನೆಲೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, SalⅠ ಗೆ ಯಾವುದೇ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಬೇಸ್ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ, EcoRⅤ ಗೆ 1 ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಬೇಸ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, NotⅠ ಗೆ 2 ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ನೆಲೆಗಳ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಮತ್ತು ಹಿಂದ್ Ⅲ ಗೆ 3 ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ನೆಲೆಗಳ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.

ಎಲ್ಐಸಿ ಬಾಲವನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ

LIC ಯ ಪೂರ್ಣ ಹೆಸರು ಲಿಗೇಶನ್-ಇಂಡಿಪೆಂಡೆಂಟ್ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಪಿಇಟಿ ವೆಕ್ಟರ್‌ನ ಭಾಗಕ್ಕಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ನವೋಜೆನ್ ಕಂಡುಹಿಡಿದ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.LIC ವಿಧಾನದಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾದ ಪಿಇಟಿ ವಾಹಕವು ಪೂರಕವಲ್ಲದ 12-15 ಬೇಸ್ ಸಿಂಗಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಜಿಗುಟಾದ ತುದಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಗುರಿ ಸೇರಿಸುವ ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಜಿಗುಟಾದ ತುದಿಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸುತ್ತದೆ.ವರ್ಧನೆಯ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ, ಸೇರಿಸಲಾದ ತುಣುಕಿನ ಪ್ರೈಮರ್ 5′ ಅನುಕ್ರಮವು LIC ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿರಬೇಕು.T4 ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ 3′→5′ ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾನೆಕ್ಟ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಸ್ವಲ್ಪ ಸಮಯದ ನಂತರ ಸೇರಿಸಲಾದ ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಒಂದೇ ಎಳೆಯನ್ನು ಜಿಗುಟಾದ ತುದಿಯನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು.ತಯಾರಾದ ಇನ್ಸರ್ಟ್ ತುಣುಕು ಮತ್ತು ವೆಕ್ಟರ್ನ ಪರಸ್ಪರ ಅನೆಲಿಂಗ್ನಿಂದ ಮಾತ್ರ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದಾದ್ದರಿಂದ, ಈ ವಿಧಾನವು ಅತ್ಯಂತ ವೇಗವಾಗಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇದು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ದೇಶಿಸುತ್ತದೆ.
ನಿರ್ದೇಶಿಸಿದ TA ಕ್ಲೋನ್ ಆಡ್ ಟೈಲ್
TA ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಯು ವೆಕ್ಟರ್ ಆಗಿ ತುಣುಕನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ನಂತರ ಇನ್ವಿಟ್ರೊಜೆನ್ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಯನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿತು, ಇದು ಒಂದು ತುದಿಯಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ಪ್ರಮುಖ ಬೇಸ್ GTGGS ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ, ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಅದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಸೇರಿಸಬೇಕು, ಆದ್ದರಿಂದ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು "ಆಧಾರಿತ" ಮಾಡಬಹುದು.

ನಿಮಗೆ ಸಮಯ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ನೀವು ನೇರ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಬಹುದು, ಜೀನ್ ಅನ್ನು ವೆಕ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಬಹುದು, ಇದನ್ನು ನಾವು ಮ್ಯೂಸಿಕ್ಯುಲರಿಸ್ಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇಟಿ ಜೀನ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಎಂದು ಕರೆಯುತ್ತೇವೆ.

D. ಇನ್-ಫ್ಯೂಷನ್ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ವಿಧಾನ

ಯಾವುದೇ ಲಿಗೇಸ್ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ, ದೀರ್ಘ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ಲೀನರೈಸ್ಡ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ನ ಎರಡೂ ತುದಿಗಳಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸುವವರೆಗೆ, ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನ ಮತ್ತು ರೇಖಾತ್ಮಕ ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಿಎಸ್‌ಎ ಹೊಂದಿರುವ ಇನ್-ಫ್ಯೂಷನ್ ಕಿಣ್ವದ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅರ್ಧ ಘಂಟೆಯವರೆಗೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ದೊಡ್ಡ ಪರಿಮಾಣದ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ ಈ ವಿಧಾನವು ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.

10. ವಿಲೀನ ಪ್ರೈಮರ್

ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ಬಗ್ಗೆ ಸೀಮಿತ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿ ಮಾತ್ರ ತಿಳಿದಿದೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಮಾತ್ರ ತಿಳಿದಿದ್ದರೆ, ವಿಲೀನಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬಹುದು.ವಿಲೀನ ಪ್ರೈಮರ್ ಒಂದು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುವ ಎಲ್ಲಾ ವಿಭಿನ್ನ ಬೇಸ್ ಸಾಧ್ಯತೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ವಿಭಿನ್ನ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಮಿಶ್ರಣವಾಗಿದೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು, ವಿವಿಧ ಜೀವಿಗಳ ಮೂಲ ಬಳಕೆಯ ಆದ್ಯತೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸೇರ್ಪಡೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಕೋಡಾನ್ ಬಳಕೆಯ ಕೋಷ್ಟಕವನ್ನು ನೀವು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಬಹುದು.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೈಪೋಕ್ಸಾಂಥೈನ್ ಅನ್ನು ಎಲ್ಲಾ ಬೇಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಬಹುದು.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಅನೆಕ್ಸೆಡ್ ಬೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಡಿ ಏಕೆಂದರೆ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ 3 ಬೇಸ್‌ಗಳ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಪ್ಪು ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ PCR ಅನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು (1μM ನಿಂದ 3μM) ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅನೇಕ ಸೇರ್ಪಡೆ ಮಿಶ್ರಣಗಳಲ್ಲಿನ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಗುರಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ.

ಪಿಸಿಆರ್ ಕಚ್ಚಾ ವಸ್ತುಗಳುನಿಯಂತ್ರಣ

1. ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರಮಾಣ

ಪ್ರತಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 0.1 ~ 1umol ಅಥವಾ 10 ~ 100pmol ಆಗಿದೆ.ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣದ ಪ್ರೈಮರ್ನೊಂದಿಗೆ ಉತ್ಪಾದಿಸುವುದು ಉತ್ತಮ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಅಸಾಮರಸ್ಯ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸುವ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.

2. ಪ್ರೈಮರ್ ಏಕಾಗ್ರತೆ

ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 0.1 ಮತ್ತು 0.5μM ನಡುವೆ ಇರುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ.

3. ಪ್ರೈಮರ್ನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ

ಪ್ರೈಮರ್ಗಳಿಗೆ ಮತ್ತೊಂದು ಪ್ರಮುಖ ನಿಯತಾಂಕವೆಂದರೆ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನ (Tm).50% ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅಣುಗಳಾಗಿ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಿದಾಗ ಇದು ತಾಪಮಾನವಾಗಿದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು Tm ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ತಾತ್ತ್ವಿಕವಾಗಿ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚು.55℃ ರಿಂದ 70℃ ವರೆಗೆ ಸಮಂಜಸವಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ Tm ಗಿಂತ 5℃ ಕಡಿಮೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.

Tm ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ಹಲವಾರು ಸೂತ್ರಗಳಿವೆ, ಇದು ಬಳಸಿದ ಸೂತ್ರ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಹೆಚ್ಚು ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಸೂತ್ರಗಳು ಅಂದಾಜು Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಒದಗಿಸುವುದರಿಂದ, ಎಲ್ಲಾ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಗಳು ಕೇವಲ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತವಾಗಿದೆ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹಂತಹಂತವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಹಲವಾರು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಅಂದಾಜು Tm-5℃ ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ, ಮತ್ತು 2℃ ಹೆಚ್ಚಳದಲ್ಲಿ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಉತ್ತಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗಾಗಿ, ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಂದಾಜು Tm ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು.ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿಗಳ Tm ವ್ಯತ್ಯಾಸವು 5℃ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ತಪ್ಪು ಪ್ರಾರಂಭವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು Tm ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿದ್ದರೆ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕಡಿಮೆ Tm ಗಿಂತ 5℃ ಕಡಿಮೆಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ.ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು, ಹೆಚ್ಚಿನ Tm ಗಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಐದು ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ಮೊದಲು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು, ನಂತರ ಕಡಿಮೆ Tm ಗಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಉಳಿದ ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು.ಇದು ಬಿಗಿಯಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಗಮ್ಯಸ್ಥಾನದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಭಾಗಶಃ ನಕಲನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.

4. ಪ್ರೈಮರ್ ಶುದ್ಧತೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆ

ಹೆಚ್ಚಿನ PCR ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಸ್ಟಮ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಶುದ್ಧತೆಯು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ.ಡೀಸಾಲ್ಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಬೆನ್ಝಾಯ್ಲ್ ಮತ್ತು ಐಸೊಬ್ಯುಟೈಲ್ ಗುಂಪುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು ಕಡಿಮೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಕೆಲವು ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಈ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಸಂಭವಿಸುತ್ತವೆ ಏಕೆಂದರೆ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರದ ದಕ್ಷತೆಯು 100% ಅಲ್ಲ.ಇದು ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿದ್ದು, ಪುನರಾವರ್ತಿತ ರಾಸಾಯನಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರತಿ ಬೇಸ್ ಅನ್ನು 3′ ರಿಂದ 5′ ವರೆಗೆ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಡಲು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನೀವು ಯಾವುದೇ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ವಿಫಲರಾಗಬಹುದು.ಉದ್ದವಾದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ 50 ಬೇಸ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನವು, ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಅಗತ್ಯವಿರಬಹುದು.

ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಇಳುವರಿಯು ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನದ ದಕ್ಷತೆಯಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಸೈಟೋಲಜಿ ಮತ್ತು ಶೆಂಗಾಂಗ್‌ನಂತಹ ಬಯೋಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ ಕಂಪನಿಗಳು ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್‌ನ ಒಟ್ಟು ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಕನಿಷ್ಠ OD ಘಟಕವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ.ಕಸ್ಟಮ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಒಣ ಪುಡಿ ರೂಪದಲ್ಲಿ ರವಾನಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 100μM ಆಗಿರುವುದರಿಂದ TE ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪುನಃ ಕರಗಿಸುವುದು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿಗಿಂತ TE ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ನೀರಿನ pH ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಆಮ್ಲೀಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್‌ಗಳ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.

ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಯು ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಒಣ ಪುಡಿ ಮತ್ತು ಕರಗಿದ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು -20℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು.10μM ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ TE ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು 6 ತಿಂಗಳವರೆಗೆ -20℃ ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ 1 ವಾರಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಕಾಲ ಕೊಠಡಿ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ (15 ° ನಿಂದ 30 °) ಮಾತ್ರ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.ಡ್ರೈ ಪೌಡರ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಕನಿಷ್ಠ 1 ವರ್ಷಕ್ಕೆ -20 ಸಿ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ (15 ಸಿ ನಿಂದ 30 ಸಿ) 2 ತಿಂಗಳವರೆಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.

5. ಕಿಣ್ವಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು

ಪ್ರಸ್ತುತ, ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮೂಲತಃ ಕೋಲಿಫಾರ್ಮ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಜೀನ್ ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವವಾಗಿದೆ.ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧನೆ ಮಾಡಲು ಬೇಕಾದ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣವು ಸುಮಾರು 2.5U (100ul ನ ಒಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ).ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು;ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಉತ್ಪನ್ನದ ಪ್ರಮಾಣವು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ.

6. dNTP ಯ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆ

dNTP ಯ ಗುಣಮಟ್ಟವು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ದಕ್ಷತೆಗೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ.ಡಿಎನ್‌ಟಿಪಿ ಪೌಡರ್ ಹರಳಿನಂತಿದ್ದು, ಅದನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸದಿದ್ದರೆ ಅದರ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯು ಅದರ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.dNTP ದ್ರಾವಣವು ಆಮ್ಲೀಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಬೇಕು, 1M NaOH ಅಥವಾ 1M Tris.HCL ಬಫರ್ ಪರಿಹಾರದೊಂದಿಗೆ ಅದರ PH ಅನ್ನು 7.0 ~ 7.5 ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲು, ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಉಪ-ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್, -20℃ ನಲ್ಲಿ ಘನೀಕೃತ ಸಂಗ್ರಹಣೆ.ಬಹು ಫ್ರೀಜ್-ಕರಗಿಸುವಿಕೆಯು dNTP ಅನ್ನು ಕೆಡಿಸುತ್ತದೆ.PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, dNTP 50 ~ 200umol/L ಆಗಿರಬೇಕು.ವಿಶೇಷವಾಗಿ, ನಾಲ್ಕು ಡಿಎನ್‌ಟಿಪಿಎಸ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಮಾನವಾಗಿರಬೇಕು (ಸಮಾನ ಮೋಲ್ ತಯಾರಿಕೆ) ಗಮನವನ್ನು ನೀಡಬೇಕು.ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದಾದರೂ ಏಕಾಗ್ರತೆ ಇತರರಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದ್ದರೆ (ಹೆಚ್ಚು ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ), ಅಸಾಮರಸ್ಯ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ.ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.dNTP Mg2+ ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಉಚಿತ Mg2+ ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು.

7. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ (ಗುರಿ ಜೀನ್) ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ

ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಮಟ್ಟವು PCR ನ ಯಶಸ್ಸು ಅಥವಾ ವೈಫಲ್ಯದ ಪ್ರಮುಖ ಲಿಂಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ.ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಎಸ್‌ಡಿಎಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಕೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಜೀರ್ಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಮತ್ತು ವಿಲೇವಾರಿ ಮಾಡಲು ಬಳಸುತ್ತವೆ.SDS ನ ಮುಖ್ಯ ಕಾರ್ಯಗಳೆಂದರೆ: ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯ ಮೇಲೆ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸಿ, ಪೊರೆಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯನ್ನು ನಾಶಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದಲ್ಲಿ ಪರಮಾಣು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ, SDS ಸಹ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸುತ್ತದೆ;ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಕೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಜೀರ್ಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಬಂಧಿತವಾದ ಹಿಸ್ಟೋನ್‌ಗಳು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ಜೀವಕೋಶದ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಸಾವಯವ ದ್ರಾವಕ ಫೀನಾಲ್ ಮತ್ತು ಕ್ಲೋರೊಫಾರ್ಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲು ಎಥೆನಾಲ್ ಅಥವಾ ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್ ಆಲ್ಕೋಹಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ.ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.ಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಪತ್ತೆ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸಲು, ಲೈಸೇಟ್ ರೋಗಕಾರಕಗಳನ್ನು ಜೀರ್ಣಿಸಲು ಮತ್ತು ಕ್ರೋಮೋಸೋಮ್‌ಗಳಿಂದ ಮುಕ್ತ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ತ್ವರಿತ ಮತ್ತು ಸರಳ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನೇರವಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಐಸೊಥಿಯೋಸೈನೇಟ್ ಅಥವಾ ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಕೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಆರ್ಎನ್ಎ ಅನ್ನು ಕೆಡದಂತೆ ತಡೆಯುತ್ತದೆ.

8.Mg2+ ಸಾಂದ್ರತೆ

ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿ ಮೇಲೆ Mg2+ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ವಿವಿಧ dNTP ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 200umol/L ಆಗಿದ್ದರೆ, Mg2+ ನ ಸೂಕ್ತ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 1.5 ~ 2.0mmol/L ಆಗಿರುತ್ತದೆ.Mg2+ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ, ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯು Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಕಡಿತ.

ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳು ಪಿಸಿಆರ್ನ ಹಲವಾರು ಅಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆ, ಇದು ಇಳುವರಿ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ;ಮತ್ತೊಂದು ಉದಾಹರಣೆಯೆಂದರೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನೆಲಿಂಗ್, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.dNTP ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ, ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಉಚಿತ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನಿನ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ 200μM dNTP ಯೊಂದಿಗೆ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ PCR ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 1.5mM ಆಗಿದೆ (ಗಮನಿಸಿ: ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಗಾಗಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತನಿಖೆಯೊಂದಿಗೆ 3 ರಿಂದ 5mM ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಬಳಸಿ).ಉಚಿತ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿಷ್ಠೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಟೈಟರೇಶನ್‌ಗಳನ್ನು 1mM ನಿಂದ 3mM ವರೆಗೆ 0.5mM ಹೆಚ್ಚಳದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಮೇಲಿನ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು, ಪ್ಲಾಟಿನಮ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಟಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಿಂತ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಕಡಿಮೆ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.

9. ಪಿಸಿಆರ್-ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳು

ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ;ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹೆಚ್ಚಿನ GC ವಿಷಯವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಕೆಲವು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಕ್ರಮಗಳ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಡಿಎನ್ಎ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳು ಉತ್ಪನ್ನದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಮತ್ತೊಂದು ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಉತ್ತಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.

ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಪ್ರೈಮರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವದ ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.

ಫಾರ್ಮೈಡ್, DMSO, ಗ್ಲಿಸರಿನ್, ಬೀಟೈನ್ ಮತ್ತು PCRx ವರ್ಧಕ ಪರಿಹಾರ ಸೇರಿದಂತೆ PCR ಸೇರ್ಪಡೆಗಳು ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತವೆ.ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು ಅವರ ಸಂಭವನೀಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವಾಗಿದೆ, ಹೀಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನೆಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶದ ಮೂಲಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ವಿಸ್ತರಣೆಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.PCRx ಪರಿಹಾರವು ಇತರ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಟಿನಮ್ ಪಿಎಫ್‌ಎಕ್ಸ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬಳಸಿದಾಗ ಕನಿಷ್ಠ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಹೀಗಾಗಿ, ಪ್ಲಾಟಿನಂ ತಂತ್ರವು ಮೂರನೇ ವಿಧಾನದ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವಾಗ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಂಯೋಜಕದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್.ಉತ್ತಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗಾಗಿ, ಸೇರ್ಪಡೆಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ ಮಾಡಬೇಕು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ DMSO, ಫಾರ್ಮೈಡ್ ಮತ್ತು ಗ್ಲಿಸರಾಲ್, ಇದು Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.

 ಫೋರ್ಸಿ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್

10. ಬಿಸಿ ಆರಂಭ

ಉತ್ತಮ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ಜೊತೆಗೆ ಪಿಸಿಆರ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಮುಖ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ.Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾದ ಉದ್ದನೆಯ ಉಷ್ಣತೆಯು 72℃ ಆಗಿದ್ದರೂ, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಹೀಗಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ತಯಾರಿಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಉಷ್ಣ ಚಕ್ರದ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ಹಿಡುವಳಿ ತಾಪಮಾನವು ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಾದಾಗ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಒಮ್ಮೆ ರೂಪುಗೊಂಡ ನಂತರ, ಈ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಆನುವಂಶಿಕ ಅಂಶಗಳ ಸ್ಥಳದಿಂದ ಸೀಮಿತವಾದಾಗ ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ PCR ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಸೈಟ್-ನಿರ್ದೇಶಿತ ರೂಪಾಂತರಗಳು, ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್, ಅಥವಾ ಡಿಎನ್‌ಎ ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್‌ಗೆ ಬಳಸುವ ಆನುವಂಶಿಕ ಅಂಶಗಳ ನಿರ್ಮಾಣ ಮತ್ತು ಕುಶಲತೆ.

ಟಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸುವ ಒಂದು ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿಧಾನವೆಂದರೆ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ತಯಾರಿಸುವುದು ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಕಾಯಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪಿಸಿಆರ್ ಉಪಕರಣದಲ್ಲಿ ಇಡುವುದು.ಈ ವಿಧಾನವು ಸರಳ ಮತ್ತು ಅಗ್ಗವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದಿಲ್ಲ.

ಪಿಸಿಆರ್ ಉಪಕರಣವು ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಘಟಕವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಥರ್ಮಲ್ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ DNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ವಿಳಂಬಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ತಡವಾದ ಸೇರ್ಪಡೆ ಸೇರಿದಂತೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಥರ್ಮಲ್ ಇನಿಶಿಯೇಶನ್ ವಿಧಾನಗಳು ತೊಡಕಾಗಿರುತ್ತವೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ.ಇತರ ಥರ್ಮಲ್ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ ಕಿಣ್ವಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಅಗತ್ಯ ಘಟಕವನ್ನು ಸುತ್ತುವರಿಯಲು ಅಥವಾ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಬಫರ್‌ಗಳಂತಹ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಭೌತಿಕವಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಮೇಣದ ಕವಚವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ.ಉಷ್ಣ ಚಕ್ರದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಮೇಣದ ಕರಗಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಘಟಕಗಳು ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಮಿಶ್ರಣವಾಗುತ್ತವೆ.ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ವಿಧಾನದಂತೆ, ವ್ಯಾಕ್ಸ್ ಶೀಲ್ಡ್ ವಿಧಾನವು ತೊಡಕಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯಕ್ಕೆ ಗುರಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಲ್ಲ.

ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ಅನುಕೂಲಕರ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ.ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಟ್ಯಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಟ್ಯಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ವಿರುದ್ಧ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ.ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ತಾಪಮಾನ ಹಿಡಿದಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳುವಾಗ ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು PCR ನಿಂದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ.ಟಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಹಂತದ 94 ℃ ನಿರೋಧನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಪೂರ್ಣ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮರುಸ್ಥಾಪಿಸುತ್ತದೆ.ಥರ್ಮಲ್ ಇನಿಶಿಷನ್‌ಗಾಗಿ ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಕಿಣ್ವವು 94℃ (10 ರಿಂದ 15 ನಿಮಿಷಗಳು) ನಲ್ಲಿ ದೀರ್ಘವಾದ ನಿರೋಧನದ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ.PlatinumTaq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ, 90% Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು 2 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ 94℃ ನಲ್ಲಿ ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಯಿತು.

ಫೊರೆಸಿ ಎಚ್ಎಸ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್

11. ನೆಸ್ಟ್-ಪಿಸಿಆರ್

ನೆಸ್ಟೆಡ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್‌ನ ಸತತ ಸುತ್ತುಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.ಮೊದಲ ಸುತ್ತು 15 ರಿಂದ 20 ಚಕ್ರಗಳ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವರ್ಧನೆಯಾಗಿದೆ.ಆರಂಭಿಕ ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನದ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಭಾಗವನ್ನು 100 ರಿಂದ 1000 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 15 ರಿಂದ 20 ಚಕ್ರಗಳಿಗೆ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ವರ್ಧನೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ, ಆರಂಭಿಕ ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಜೆಲ್ ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಮೂಲಕ ಗಾತ್ರ ಮಾಡಬಹುದು.ನೆಸ್ಟೆಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ವರ್ಧನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಮೊದಲ ಪ್ರೈಮರ್‌ನೊಳಗಿನ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ನೆಸ್ಟೆಡ್ PCR ನ ಬಳಕೆಯು ಬಹು ಗುರಿ ಸೈಟ್‌ಗಳ ವರ್ಧನೆಯ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಎರಡೂ ಸೆಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಕೆಲವು ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿವೆ.ಅದೇ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಅದೇ ಒಟ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಚಕ್ರಗಳು (30 ರಿಂದ 40) ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸುತ್ತವೆ.ನೆಸ್ಟೆಡ್ PCR ಸೀಮಿತ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (ಉದಾ, ಅಪರೂಪದ mrnas) ಮತ್ತು ಕಷ್ಟಕರವಾದ PCRS ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ (ಉದಾ 5′ RACE).

12. ಅವರೋಹಣ PCR

ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಮೊದಲ ಕೆಲವು ಚಕ್ರಗಳಿಗೆ ಬಿಗಿಯಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ ಅವರೋಹಣ ಪಿಸಿಆರ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.ಆವರ್ತವು ಅಂದಾಜು Tm ಗಿಂತ ಸರಿಸುಮಾರು 5℃ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು Tm 5℃ ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇರುವವರೆಗೆ ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರವನ್ನು 1℃ ರಿಂದ 2℃ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅತ್ಯಧಿಕ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಗಮ್ಯಸ್ಥಾನದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ವರ್ಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ನಂತರದ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ ವಿಸ್ತರಿಸುವುದನ್ನು ಮುಂದುವರೆಸುತ್ತವೆ, ವರ್ಧಿತ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಗುಂಪುಗೂಡಿಸುತ್ತದೆ.AFLP ಡಿಎನ್‌ಎ ಫಿಂಗರ್‌ಪ್ರಿಂಟಿಂಗ್‌ನಂತಹ ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಡುವಿನ ಹೋಮಾಲಜಿಯ ಮಟ್ಟವು ತಿಳಿದಿಲ್ಲದ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಅವರೋಹಣ ಪಿಸಿಆರ್ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ.

ಸಂಬಂಧಿತ PCR ಕಿಟ್‌ಗಳು

 ಪಿಸಿಆರ್ ಸುಲಭ (ವರ್ಣದೊಂದಿಗೆ)

2× PCR ಹೀರೋ^TMಸಾಮಾನ್ಯ ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಕ್ಸ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗಿಂತ ಮಿಕ್ಸ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಸಂಕೀರ್ಣ ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್‌ಗಳ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯೊಂದಿಗೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ನಿಭಾಯಿಸಬಹುದು.ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ದಕ್ಷತೆಯ Taq Hero ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.

 PCR Heroᴹ (ಬಣ್ಣದೊಂದಿಗೆ)

ಹೆಚ್ಚಿನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ

ಇದು 5'→3' DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು 5'→3' ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, 3'→5' ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಲ್ಲದೆ.

ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ PCR Easyᴹ-SYBR ಗ್ರೀನ್ ಐ ಕಿಟ್

ನಿರ್ದಿಷ್ಟ-ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಬಫರ್ ಮತ್ತು ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಾಕ್ ಕಿಣ್ವವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ

ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂವೇದನೆ - ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡಬಹುದು

RT-PCR ಸುಲಭ I(ಒಂದು ಹಂತ)

ಕಿಟ್ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಫೋರೆಜೀನ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕಾರಕವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಫೋರ್ಜೀನ್ ಹಾಟ್‌ಸ್ಟಾರ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.