RT-qPCR ಪ್ರಯೋಗವು RNA ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ, ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮತ್ತು qPCR ಮೂರು ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಪ್ರತಿ ಹಂತವು ಸಾಕಷ್ಟು ಮುನ್ನೆಚ್ಚರಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ನಾವು ಕೆಳಗೆ ವಿವರವಾಗಿ ಪರಿಚಯಿಸುತ್ತೇವೆ.

Ⅰ.ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ

RT-qPCR ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅರ್ಹತೆ ಪಡೆದ ನಂತರವೇ ಅನುಸರಣಾ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಬಹುದು.ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್, ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್, ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಸೇರಿವೆ, ಇವುಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಮತ್ತು ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ವಿಧಾನ ಪತ್ತೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆ, ಶುದ್ಧತೆ ಮತ್ತು ಸಮಗ್ರತೆಯ ಪತ್ತೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಈ ಎರಡು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಬಳಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು.

ಸಂಬಂಧಿತ RNA ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಕಿಟ್: 

ಸೆಲ್ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಕಿಟ್

ಹೆಚ್ಚು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ವಿವಿಧ ಕಲ್ಚರ್ಡ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ 11 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಬಹುದು.

ಅನಿಮಲ್ ಟೋಟಲ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಐಸೋಲೇಶನ್ ಕಿಟ್

ವಿವಿಧ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಶುದ್ಧತೆ ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ.

ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್:

ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಆರ್ಎನ್ಎ ಮತ್ತು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಅವುಗಳಲ್ಲಿ, A260/280 ಮತ್ತು A260/230 ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಪ್ರಮುಖ ನಿಯತಾಂಕಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಮೌಲ್ಯಗಳ ಏರಿಳಿತದ ಪ್ರಕಾರ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA ಶುದ್ಧತೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ;A260/280<1.9, RNA ಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಶೇಷ ಇರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ;A260/280>2.1, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಂಭವನೀಯ ಭಾಗಶಃ ಅವನತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಿಂದ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢೀಕರಿಸಬಹುದು.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA ಶುದ್ಧತೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ;A260/230< 2.0, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಫೀನಾಲ್‌ಗಳು, ಎಥೆನಾಲ್ ಅಥವಾ ಸಕ್ಕರೆಗಳಂತಹ ಸಾವಯವ ಕಾರಕಗಳ ಅವಶೇಷಗಳು ಇರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್:

ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆ, ಜೀನೋಮ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಅಳೆಯಲು ಅಥವಾ ಸಾವಯವ ಕಾರಕಗಳ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ:

1. ಆರ್ಎನ್ಎ ಅಗಾರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ಗೆ ಒಳಪಟ್ಟಿತು.ಜೆಲ್ ನಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ 28sRNA, 18sRNA ಮತ್ತು 5.8sRNA ಯ ಮೂರು ಏಕ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಮಾತ್ರ ಇದ್ದಲ್ಲಿ, ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNA ಅಖಂಡವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಎಳೆಯುವ ವಿದ್ಯಮಾನವಿದ್ದರೆ, ಇದು ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಭಾಗಶಃ ಅವನತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

2. ಅಂಟು ರಂಧ್ರ ಮತ್ತು 28sRNA ಬ್ಯಾಂಡ್ ನಡುವೆ ಒಂದೇ ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಇದ್ದರೆ, ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಶೇಷ ಇರಬಹುದು.

3. ಅಂಟು ರಂಧ್ರದಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಂಡ್ಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡರೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಪದಾರ್ಥಗಳ ಅವಶೇಷಗಳು ಇರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

Ⅱ. ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ

ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ ಅದನ್ನು cDNA ಗೆ ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಹಿಮ್ಮುಖ ಹಂತವು ಅತ್ಯಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ:

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆಯ್ಕೆ:

ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ AMV RTase ಮತ್ತು MMLV RTase ಸೇರಿವೆ.AMV RTase ನ RNase H ಪ್ರಬಲ ಚಟುವಟಿಕೆ, ಕಡಿಮೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಉದ್ದ, ಕಡಿಮೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ (42 ~ 55℃) ಹೊಂದಿದೆ.MMLV RTase ನ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯು ದುರ್ಬಲವಾಗಿದೆ, ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಉದ್ದವು ಉದ್ದವಾಗಿದೆ, ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಮಾಣವು ಅಧಿಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಕಳಪೆಯಾಗಿದೆ (37 ~ 42℃).

RNase H ಕಿಣ್ವವು RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕೆಡಿಸುವ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ MMLV ಅನ್ನು ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬೇಕು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಜೆನೆಟಿಕ್ ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ನಂತರ, MMLV ಯ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯು ಗುಣಾತ್ಮಕ ಅಧಿಕವನ್ನು ತಲುಪಿದೆ.ಫೋರ್ಜೀನ್ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುವುದುಫೊರೆಸಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ M-MLV) ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ, ಇದು ಜೆನೆಟಿಕ್ ರಿಕಾಂಬಿನೇಶನ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು E. ಕೊಲಿ ಇಂಜಿನಿಯರ್ಡ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಹೊಸ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆಗಿದೆ.ಇದು ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಏಕ-ಎಳೆಯ RNA, DNA, ಅಥವಾ RNA:DNA ಹೈಬ್ರಿಡ್‌ನಿಂದ ಪೂರಕವಾದ DNA ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ.ಇದು ಯಾವುದೇ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಬಲವಾದ ಸ್ಥಿರತೆ, ಬಲವಾದ RNA ಬಾಂಧವ್ಯ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪತ್ತೆ ಸಂವೇದನೆ.

 

ಫೊರೆಸಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ M-MLV)

ಪ್ರೈಮರ್ ಆಯ್ಕೆ:

ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಆರ್‌ಟಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮೂರು ವರ್ಗಗಳಾಗಿ ಬರುತ್ತವೆ: ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು.ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಬಳಕೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.

1. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಮೂಲದ್ದಾಗಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ವಾಡಿಕೆಯ PCR ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ತಡವಾದ cDNA ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, Oligo (dT) ಅನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ;ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು qPCR ಗೆ ಮಾತ್ರ ಬಳಸಿದರೆ, ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಒಲಿಗೊ (dT) ಅನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

2. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರೊಕಾರ್ಯೋಟ್‌ಗಳಿಂದ ಬಂದಿದ್ದರೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ರಾಂಡಮ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬೇಕು.

Ⅲ.qPCR

ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ತತ್ವಗಳು, ROX ಆಯ್ಕೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಸಂರಚನೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್ ಇತ್ಯಾದಿ.

ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳ ಆಯ್ಕೆ:

ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ಕೆಲವು ಚಿಕಿತ್ಸಾ ವಿಧಾನಗಳ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು, ವಿಭಿನ್ನ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೋಲಿಸಲು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ವೈರಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೀಗೆ.ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಮಾಡುವಾಗ, ನಾವು ನಮ್ಮ ಸ್ವಂತ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸೂಕ್ತವಾದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಆರಿಸಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.

ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ತತ್ವಗಳು:

qPCR ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ನ ವಿನ್ಯಾಸವು ನೇರವಾಗಿ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಉತ್ಪನ್ನದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಉತ್ತಮ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದು ಯಶಸ್ವಿ qPCR ನ ಮೊದಲ ಹಂತವಾಗಿದೆ.ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ, ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ತತ್ವವನ್ನು ಪೂರೈಸುವಾಗ ಈ ಕೆಳಗಿನ ತತ್ವಗಳಿಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು:

1. ಗುರಿಯ ತುಣುಕಿನ ಉದ್ದವನ್ನು 100 ಮತ್ತು 300 ಬಿಪಿ ನಡುವೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ;

2. ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಕ್ರಾಸ್-ಎಕ್ಸಾನ್ ವಿನ್ಯಾಸ;

3. ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಪ್ರಮಾಣಿತ (90-110%) ಅನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ ಮಾತ್ರ ಅವುಗಳನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಬಳಸಬಹುದು;

4. ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 0.1uM ಮತ್ತು 1.0uM ನಡುವೆ ಹೊಂದುವಂತೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

ನ ಆಯ್ಕೆROX:

ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ROX ಆವಿಯಾಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಘನೀಕರಣದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಪಥ ವ್ಯತ್ಯಾಸ, ಪೈಪೆಟಿಂಗ್ ದೋಷ ಅಥವಾ ಪರಿಮಾಣ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಏಕರೂಪವಾಗಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು, ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಪುನರಾವರ್ತಿತತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ROX ನ ಆಯ್ಕೆಯು ಉಪಕರಣಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು.qPCR ಉಪಕರಣವು ರಂಧ್ರಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಸರಿಪಡಿಸುವ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಅದು ROX ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ;ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಇದು ROX ತಿದ್ದುಪಡಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಖರೀದಿಸುವಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಪಾಲುದಾರರು ಸರಿಯಾದ ROX ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಬಳಸುವ ಉಪಕರಣದ ಪ್ರಕಾರ ಇರಬೇಕು, ನಂತರದ ತಪ್ಪುಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.

ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ತಯಾರಿ:

20ul ಮತ್ತು 50ul ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣಗಳನ್ನು ಆದ್ಯತೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುವಾಗ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಅಂಶಗಳಿಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು:

1. ಅಲ್ಟ್ರಾ-ಕ್ಲೀನ್ ವರ್ಕ್‌ಬೆಂಚ್, ಹೊಸ ಡಿಡಿಹೆಚ್‌ನಲ್ಲಿ ವಾತಾಯನದ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ₂ಪ್ರತಿ ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕೆ O ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ;

2. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಪ್ರಯೋಗವು ಸಿಸ್ಟಂನಲ್ಲಿ ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು NTC ಅನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಮತ್ತು ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸುವಾಗ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು NTC ಅನ್ನು ಮಾಡಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ;

3. ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಜಿಡಿಎನ್‌ಎ ಶೇಷವಿದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು, ಪತ್ತೆಗಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಎನ್‌ಆರ್‌ಟಿಯನ್ನು ತಯಾರಿಸಬಹುದು;

4. ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸುವಾಗ, ಒಂದು ಮಾದರಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 3 ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳನ್ನು ಮಾಡಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ;

5. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ cDNA ಆಗಿರುವಾಗ, qPCR ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು 5-10 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಮೂಲಕ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ CT ಮೌಲ್ಯವು 20-30 ರ ನಡುವೆ ಬೀಳುತ್ತದೆ;

6. ಅಗತ್ಯ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ 5-10% ರಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣದ ಸಂರಚನಾ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿ;

7, ಸಿಸ್ಟಂ ಅನ್ನು ಪ್ರಿಮಿಕ್ಸ್ ತತ್ವವನ್ನು ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ನಂತರ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡುವುದು ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಗುಳ್ಳೆಗಳಿಲ್ಲ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ;

8, ಪೋಷಕ ಉಪಭೋಗ್ಯಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು.

ಸಂಬಂಧಿತ RT-qPCR ಕಿಟ್