ಕೇಂದ್ರ ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಡಿಎನ್ಎ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ನಡುವಿನ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಮಧ್ಯವರ್ತಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದಿದೆ.ಡಿಎನ್‌ಎ ಪತ್ತೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯು ಜೀವಿಗಳಲ್ಲಿನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಸ್ತುನಿಷ್ಠವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳು: qRT-PCR, RNA-Seq, ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್ ಪತ್ತೆ ಇತ್ಯಾದಿ. ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ (ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಕ್ಕರೆ ಉಂಗುರವು ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಕ್ಕರೆ ಉಂಗುರಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಉಚಿತ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಲ್ ಗುಂಪನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ), ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಆರ್‌ನೇಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸೇರಿಕೊಂಡು, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಡಿಎನ್‌ಎಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಅಸ್ಥಿರ ಮತ್ತು ಅವನತಿಗೆ ಸುಲಭವಾಗಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟ ಉತ್ತಮವಾಗಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಕಸದ ಒಳಗೆ, ಕಸವನ್ನು ಹೊರಗೆ ಹಾಕಿ, ನಂತರ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಅತೃಪ್ತಿಕರವಾಗಿರಬೇಕು, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ತಪ್ಪಾದ ಡೇಟಾ ಅಥವಾ ಕಳಪೆ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗಿ ಪ್ರಕಟವಾಗುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗಮನವನ್ನು ನೀಡಬೇಕು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾದ ನಿಖರತೆ ಮತ್ತು ನಿಖರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಗುಣಮಟ್ಟದ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಲಿಂಕ್ ಕೂಡ ಹೆಚ್ಚು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ, ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ವಿಧಾನಗಳಿವೆ:

• ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿ
• ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್
• ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್
• ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR
• ಕ್ವಿಟ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ವಿಧಾನ

01 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿ

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಂಯೋಜಿತ ಡಬಲ್ ಬಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು 260nm ತರಂಗಾಂತರದಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಗರಿಷ್ಠತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಲ್ಯಾಂಬರ್ಟ್-ಬೀರ್ ನಿಯಮದ ಪ್ರಕಾರ, ನಾವು 260nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಗರಿಷ್ಠದಿಂದ RNA ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬಹುದು.ಜೊತೆಗೆ, ನಾವು 260nm, 280nm ಮತ್ತು 230nm ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಶಿಖರಗಳ ಅನುಪಾತದ ಪ್ರಕಾರ RNA ಯ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬಹುದು.280nm ಮತ್ತು 230nm ಕ್ರಮವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಅಣುಗಳ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಶಿಖರಗಳಾಗಿವೆ.ಅರ್ಹ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಶುದ್ಧತೆಯ A260/A280 ಮತ್ತು A260/A230 ಅನುಪಾತವು 2 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರಬೇಕು. ಅದು 2 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, RNA ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಥವಾ ಸಣ್ಣ ಅಣು ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಮತ್ತೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಬೇಕು.ಮಾಲಿನ್ಯದ ಮೂಲಗಳು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ನಿಖರವಾದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಶುದ್ಧತೆಯು ನಂತರದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಅನಿವಾರ್ಯ ಗುಣಮಟ್ಟದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಲಿಂಕ್ ಆಗಿದೆ.

ಚಿತ್ರ 1. ವಿಶಿಷ್ಟ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ/ಡಿಎನ್‌ಎ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್

02 ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್

ಶುದ್ಧತೆಯ ಜೊತೆಗೆ, ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯು ಆರ್ಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸುವ ಪ್ರಮುಖ ಸೂಚಕಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಅವನತಿಯು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದಾದ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖದ ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಆವರಿಸಬಹುದಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ತುಣುಕುಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು 1% ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು.ಈ ವಿಧಾನವು ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ನೀವೇ ಕಾನ್ಫಿಗರ್ ಮಾಡಬಹುದು ಅಥವಾ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಪರೀಕ್ಷೆಗಾಗಿ ಪೂರ್ವನಿರ್ಮಿತ ಇ-ಜೆಲ್™ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ 80% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ರೈಬೋಸೋಮಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಆಗಿದೆ, ಅದರಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವು 28 ಎಸ್ ಮತ್ತು 18 ಎಸ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಸಸ್ತನಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ) ರಚಿತವಾಗಿದೆ.ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಎರಡು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಬಾರ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಅವು ಕ್ರಮವಾಗಿ 5 ಕೆಬಿ ಮತ್ತು 2 ಕೆಬಿಯಲ್ಲಿ 28 ಎಸ್ ಮತ್ತು 18 ಎಸ್ ಬ್ರೈಟ್ ಬಾರ್‌ಗಳು, ಮತ್ತು ಅನುಪಾತವು 2:1 ಕ್ಕೆ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ.ಅದು ಪ್ರಸರಣ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿದ್ದರೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಯು ಕ್ಷೀಣಿಸಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ನಂತರ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

ಚಿತ್ರ 2. ಅಗಾರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಡಿಗ್ರೇಡೆಡ್ (ಲೇನ್ 2) ಮತ್ತು ಅಖಂಡ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಲೇನ್ 3) ಹೋಲಿಕೆ

03 ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್

ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ವಿಧಾನದ ಜೊತೆಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಸರಳವಾಗಿ ಮತ್ತು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ನಾವು ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಬಹುದು.ಇದು RNA ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಮೈಕ್ರೋಫ್ಲೂಯಿಡಿಕ್ಸ್, ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಾದರಿಯ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಅಂತರ್ನಿರ್ಮಿತ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ, ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಜೈವಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಕವು ಉಲ್ಲೇಖದ ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಬಹುದು, ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಸಂಖ್ಯೆ (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ ಆರ್ಐಎನ್ ಎಂದು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) [1].RIN ನ ಮೌಲ್ಯವು ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ, RNA ಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (1 ಅತ್ಯಂತ ಕೆಳಮಟ್ಟದಲ್ಲಿದೆ, 10 ಅತ್ಯಂತ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿದೆ).ಆರ್ಎನ್ಎ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕೆಲವು ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ RIN ಅನ್ನು ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್ ಆಗಿ ಬಳಸುವುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅನುಕ್ರಮ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ NGS ಎಂದು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್‌ನ ಆನ್‌ಕೊಮೈನ್ ಪ್ಯಾನೆಲ್ ಸರಣಿಯಲ್ಲಿ ಬಿ ಸೆಲ್ ಮತ್ತು ಟಿ ಸೆಲ್ ಆಂಟಿಜೆನ್ ಗ್ರಾಹಕಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಬಳಸಲಾಗುವ ಆನ್‌ಕೊಮೈನ್™ ಹ್ಯೂಮನ್ ಇಮ್ಯೂನ್ ರೆಪರ್ಟರಿಯ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳು, ಆರ್‌ಐಎನ್ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 3 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಬಹುದು).ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ ವಿಭಿನ್ನ ಶಿಫಾರಸು ಶ್ರೇಣಿಗಳಿವೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ RIN ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ತರಬಹುದು.

ಚಿತ್ರ 3, Oncomine™ ಹ್ಯೂಮನ್ ಇಮ್ಯೂನ್ ರೆಪರ್ಟರಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, RIN 4 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾದರಿಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಓದುವಿಕೆಗಳು ಮತ್ತು T ಸೆಲ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡಬಹುದು.【2】

ಆದಾಗ್ಯೂ, RIN ಮೌಲ್ಯವು ಕೆಲವು ಮಿತಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.RIN NGS ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾದ ಗುಣಮಟ್ಟದೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, FFPE ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಇದು ಸೂಕ್ತವಲ್ಲ.FFPE ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNA ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ RIN ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರಯೋಗದ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಡೇಟಾವು ಅತೃಪ್ತಿಕರವಾಗಿರಬೇಕು ಎಂದು ಇದರ ಅರ್ಥವಲ್ಲ.ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇ ಮಾದರಿಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ನಾವು RIN ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಬೇರೆ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.RIN ಜೊತೆಗೆ, ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ DV200 ಮೌಲ್ಯವನ್ನು RNA ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ನಿಯತಾಂಕವಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಬಹುದು.DV200 ಒಂದು ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು RNA ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ 200 bp ಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾದ ತುಣುಕುಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುತ್ತದೆ.DV200 RIN ಗಿಂತ FFPE ಮಾದರಿ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಉತ್ತಮ ಸೂಚಕವಾಗಿದೆ.ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ, ಇದು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪತ್ತೆ ಮಾಡಬಹುದಾದ ಜೀನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಜೀನ್‌ಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯೊಂದಿಗೆ ಅತಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ [3].DV200 ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇಯ ಗುಣಮಟ್ಟ ಪತ್ತೆಯಲ್ಲಿನ ಕೊರತೆಗಳನ್ನು ಸರಿದೂಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾದರೂ, ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ ಇನ್ನೂ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಸಮಗ್ರವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕಗಳಿವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ.ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಸ್ವತಃ ಕೆಳಮಟ್ಟದ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು ಮತ್ತು ಉಪಯುಕ್ತ ಡೇಟಾದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು.ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವಿದೆಯೇ ಎಂದು ತಿಳಿಯಲು, ನಾವು ಮುಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು.

04 ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR

ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ವಿಧಾನವು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಆದರೆ FFPE ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ RNA ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ.ಎಜಿಲೆಂಟ್ ಜೈವಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಉಪಕರಣಗಳು ಅವುಗಳ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಅನ್ವಯದ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಪ್ರಮುಖ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಜನಪ್ರಿಯವಾಗಿವೆ.RNA ಮಾದರಿಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು GUSB (Cat no. Hs00939627) ನಂತಹ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಖರೀದಿಸಬೇಕು ಅಥವಾ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಬೇಕು.ಸಂಪೂರ್ಣ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲು ಈ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮಾನದಂಡಗಳ (ತಿಳಿದಿರುವ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ) ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ, ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ತುಣುಕು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು (ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣ (ಎಫ್‌ಆರ್‌ಕ್ಯೂ) ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ).ಎನ್‌ಜಿಎಸ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳ ಎಫ್‌ಆರ್‌ಕ್ಯೂ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಡೇಟಾ ಪರಿಮಾಣದೊಂದಿಗೆ ಅತಿ ಹೆಚ್ಚು ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.0.2ng/uL FRQ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, ಕನಿಷ್ಠ 70% ರೀಡ್‌ಗಳು ಉಲ್ಲೇಖದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಒಳಗೊಳ್ಳಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 4).

ಚಿತ್ರ 4, ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ ವಿಧಾನದಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ FRQ ಮೌಲ್ಯವು NGS ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ದತ್ತಾಂಶದೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (R2>0.9).ಕೆಂಪು ರೇಖೆಯು 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ಗೆ ಸಮಾನವಾದ FRQ ಮೌಲ್ಯವಾಗಿದೆ.【4】

FFPE ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯವಾಗುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ವಿಧಾನವು ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಬಹುದು.ನಾವು ಆಂತರಿಕ ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ (IPC) ಮತ್ತು ಅದರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನಂತರ Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು.ಯಾವುದೇ ಮಾದರಿಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ Ct ಮೌಲ್ಯವು Ct ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ ಹಿಂದುಳಿದಿದ್ದರೆ, ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

05 ಕ್ವಿಟ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ವಿಧಾನ

ಕ್ವಿಟ್ ಫ್ಲೋರೋಮೀಟರ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಸಣ್ಣ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ, ಇದು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸುಲಭವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದಲ್ಲಿ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿದೆ.ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ (ಕ್ವಿಟ್ ಡಿಟೆಕ್ಷನ್ ಕಾರಕ) ಮೂಲಕ ನಿಖರವಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಕ್ವಿಟ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಮತ್ತು pg/µL ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಬಹುದು.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುವ ಪ್ರಸಿದ್ಧ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಜೊತೆಗೆ, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್‌ನ ಇತ್ತೀಚಿನ ಹೊಸ ಮಾದರಿ, ಕ್ವಿಟ್ 4.0, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಸಹ ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.Qubit 4.0′s RNA ಪತ್ತೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು (RNA IQ Assay) ಎರಡು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವರ್ಣಗಳನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಮೂಲಕ RNAಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಈ ಎರಡು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ತುಣುಕುಗಳು ಮತ್ತು ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಬಹುದು.ಈ ಎರಡು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣಗಳು ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ದೊಡ್ಡ ತುಣುಕುಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಇದರಿಂದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಐಕ್ಯೂ (ಸಮಗ್ರತೆ ಮತ್ತು ಗುಣಮಟ್ಟ) ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.ಐಕ್ಯೂ ಮೌಲ್ಯವು ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇ ಮತ್ತು ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇ ಅಲ್ಲದ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಅನುಕ್ರಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೇಲೆ ಉತ್ತಮ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ.NGS ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಅಯಾನ್ ಟೊರೆಂಟ್™ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್‌ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಿದ RNA-Seq ಪರೀಕ್ಷಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, 4 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ IQ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾದರಿಗಳು ಕನಿಷ್ಠ 50% ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಓದುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (ಚಿತ್ರ 5).ಮೇಲೆ ತಿಳಿಸಿದ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, Qubit IQ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಹೆಚ್ಚು ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಮಯ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (ಐದು ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ), ಆದರೆ ಅಳತೆ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್ IQ ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಡೇಟಾ ಗುಣಮಟ್ಟದ ನಡುವೆ ಉತ್ತಮ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.

ಚಿತ್ರ 5, Qubit RNA IQ ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು RNA-Seq ನ ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಿದ ರೀಡ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಉತ್ತಮ ಸಂಬಂಧವಿದೆ.【5】

ಮೇಲಿನ ಪರಿಚಯದ ಮೂಲಕ, ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬರೂ ವಿಭಿನ್ನ RNA ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ ವಿಧಾನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಸಾಕಷ್ಟು ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದಾರೆ ಎಂದು ನಾನು ನಂಬುತ್ತೇನೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ, ನೀವು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದುಮಾದರಿ ಪ್ರಕಾರ ಮತ್ತು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಉಪಕರಣಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಅನುಗುಣವಾದ ವಿಧಾನ.ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮಾತ್ರ ನಾವು ಕಳಪೆ ಮಾದರಿ ಗುಣಮಟ್ಟದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ವೈಫಲ್ಯವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಬಹುದು, ಹೀಗಾಗಿ ಅಮೂಲ್ಯ ಸಮಯ, ಶಕ್ತಿ ಮತ್ತು ವೆಚ್ಚವನ್ನು ಉಳಿಸಬಹುದು.

ಉಲ್ಲೇಖ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು:

ಅನಿಮಲ್ ಟೋಟಲ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಐಸೋಲೇಶನ್ ಕಿಟ್

ಸೆಲ್ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಕಿಟ್

ಉಲ್ಲೇಖಗಳು

【1】ಶ್ರೋಡರ್, ಎ., ಮುಲ್ಲರ್, ಒ., ಸ್ಟಾಕರ್, ಎಸ್. ಮತ್ತು ಇತರರು.RIN: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾಪನಗಳಿಗೆ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ನಿಯೋಜಿಸಲು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಸಂಖ್ಯೆ.BMC ಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಬಯೋಲ್ 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ಆನ್‌ಕಮೈನ್ ಹ್ಯೂಮನ್ ಇಮ್ಯೂನ್ ರೆಪರ್ಟರಿ ಯೂಸರ್ ಗೈಡ್ (ಪಬ್. ನಂ. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】ಲೀಹ್ ಸಿ ವೆಹ್ಮಾಸ್, ಚಾರ್ಲ್ಸ್ ಇ ವುಡ್, ಬ್ರಿಯಾನ್ ಎನ್ ಚೋರ್ಲಿ, ಕ್ಯಾರೋಲ್ ಎಲ್ ಯೌಕ್, ಗೇಲ್ ಎಂ ನೆಲ್ಸನ್, ಸುಸಾನ್ ಡಿ ಹೆಸ್ಟರ್, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ವರ್ಧಿತ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಫಾರ್ಮಾಲಿನ್-ಫಿಕ್ಸ್‌ಡ್ ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್-ಎಂಬೆಡೆಡ್ ಟಿಶ್ಯೂ ಸ್ಯಾಂಪಲ್ಸ್, 102, ಆಗಸ್ಟ್ 2 ವಯಸ್ಸು 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/