1. ಆರಂಭಿಕ ತಿಳುವಳಿಕೆ

ಈ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ನಮ್ಮ ಹಿರಿಯರ ಮುಂದೆ ತಪ್ಪುಗಳನ್ನು ಮಾಡುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ನಾವು ಕೆಲವು ಪರಿಕಲ್ಪನೆಗಳು ಮತ್ತು ಪರಿಭಾಷೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು, ಉದಾಹರಣೆಗೆ:

ಪ್ರಶ್ನೆ: RT-PCR, qPCR, ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಮತ್ತು ನೈಜ-ಸಮಯದ RT-PCR ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವೇನು?

ಉತ್ತರ: ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಆಗಿದೆ(ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್, ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್), ಇದು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ನ (ಪಿಸಿಆರ್) ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ರೂಪಾಂತರವಾಗಿದೆ.ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್‌ನಲ್ಲಿ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಕಾಂಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ಆಗಿ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಇದನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್‌ನಿಂದ ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್-ಪಿಸಿಆರ್ ಮತ್ತು ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್(Quantitative Rea-ltime-PCR) ಒಂದೇ ವಿಷಯ, ಎರಡೂ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR, ಅಂದರೆ PCR ನ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಚಕ್ರವು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಡೇಟಾ ದಾಖಲೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಆರಂಭಿಕ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ನಿಖರವಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು.

ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ (ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ ಪಿಸಿಆರ್) ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ (ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್) ಎರಡನ್ನೂ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಎಂದು ಸಂಕ್ಷೇಪಿಸಿದಂತೆ ತೋರುತ್ತಿದ್ದರೂ, ಅಂತರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಸಮಾವೇಶ: ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆPCR , ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ qPCR (ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR) ಎಂದು ಸಂಕ್ಷೇಪಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ..

ಮತ್ತು ನೈಜ-ಸಮಯದ RT-PCR (RT-qPCR), ಇದು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ PCR ಆಗಿದೆ: ಮೊದಲು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ನಿಂದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ (ಆರ್‌ಟಿ) ಪಡೆದುಕೊಳ್ಳಿ, ತದನಂತರ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ (ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್) ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳು RT-qPCR ಅನ್ನು ಮಾಡುತ್ತವೆ, ಅಂದರೆ, RNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಡೌನ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಶನ್‌ನ ಸಂಶೋಧನೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬರೂ ಮಾತನಾಡುವ qPCR ವಾಸ್ತವವಾಗಿ RT-qPCR ಅನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ನೂ ಅನೇಕ DNA ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಮರೆಯಬೇಡಿ.ಹೆಪಟೈಟಿಸ್ ಬಿ ವೈರಸ್ HBV ಪತ್ತೆಯಂತಹ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.

ಪ್ರಶ್ನೆ: ಬಹಳಷ್ಟು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಅನ್ನು ಓದಿದ ನಂತರ, ವರ್ಧಿತ ತುಣುಕನ್ನು 80-300bp ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಏಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು?

ಉತ್ತರ: ಪ್ರತಿ ಜೀನ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಉದ್ದವು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ, ಕೆಲವು ಹಲವಾರು kb, ಕೆಲವು ನೂರಾರು bp, ಆದರೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವಾಗ ನಾವು ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದವು 80-300bp ಆಗಿರಬೇಕು, ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ತುಂಬಾ ಉದ್ದವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಪತ್ತೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಲ್ಲ.ಉತ್ಪನ್ನದ ತುಣುಕು ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್‌ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ.ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ನ ಉದ್ದವು ಸುಮಾರು 30-40bp ಆಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಇದು 80bp ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ ಅದು ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ ಅಥವಾ ಉತ್ಪನ್ನವೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ.ಉತ್ಪನ್ನದ ತುಣುಕು ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾಗಿದ್ದರೆ, 300bp ಮೀರಿದರೆ, ಅದು ಸುಲಭವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.

ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ತರಗತಿಯಲ್ಲಿ ಎಷ್ಟು ಜನರು ಇದ್ದಾರೆ ಎಂದು ನೀವು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದಾಗ, ಎಷ್ಟು ಬಾಯಿಗಳಿವೆ ಎಂದು ನೀವು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.ನೀವು ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡಿದಾಗ ಅದೇ ನಿಜ, ಸಂಪೂರ್ಣ ಅನುಕ್ರಮವು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲು ನೀವು ಜೀನ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬೇಕು.ನೀವು ಜನರನ್ನು ಎಣಿಸಲು ಬಯಸಿದರೆ, ನೀವು ಬಾಯಿ ಮತ್ತು ಮೂಗು, ಕಿವಿ ಮತ್ತು ಕನ್ನಡಕ ಎರಡನ್ನೂ ಎಣಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ತಪ್ಪುಗಳನ್ನು ಮಾಡುವುದು ಸುಲಭ.

ವಿಸ್ತರಿಸಲು, ಜೈವಿಕ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ, ಬಿಂದುವಿನಿಂದ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಅನೇಕ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರಕರಣಗಳಿವೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಯಾವುದೇ ಜಾತಿಯ ಜೀನ್ ಅನುಕ್ರಮವು ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ 16S ಅನುಕ್ರಮದಂತಹ ಎಲ್ಲಾ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಅಳೆಯುವುದು ಅನಗತ್ಯ ಮತ್ತು ಅಸಾಧ್ಯವಾಗಿದೆ, ಇದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳುವುದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳು.

ಪ್ರಶ್ನೆ: qPCR ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಉದ್ದ ಯಾವುದು?

ಉತ್ತರ: ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವು ಸುಮಾರು 20-24bp ಆಗಿದೆ, ಇದು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವಾಗ ನಾವು ಪ್ರೈಮರ್ನ TM ಮೌಲ್ಯಕ್ಕೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ.ಸಾಕಷ್ಟು ಪ್ರಯೋಗಗಳ ನಂತರ, 60 ° C ಉತ್ತಮ TM ಮೌಲ್ಯ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಅದು ಸುಲಭವಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನ ಉತ್ತುಂಗವು ನಂತರ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CT ಮೌಲ್ಯವು ವಿಳಂಬವಾಗುತ್ತದೆ.

ಪ್ರಶ್ನೆ: ಡೈ ವಿಧಾನವು ತನಿಖೆಯ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಹೇಗೆ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ?

ಉತ್ತರ: ಡೈ ವಿಧಾನSYBR ಗ್ರೀನ್ Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ಇತ್ಯಾದಿಗಳಂತಹ ಕೆಲವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣಗಳು ತಾವಾಗಿಯೇ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಯ ಚಿಕ್ಕ ತೋಡಿಗೆ ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, ಯಂತ್ರವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಅನೆಲಿಂಗ್-ವಿಸ್ತರಣೆ ಹಂತವನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ತೆರೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಕ್ರಿಯೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಹೊಸ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣುವು ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎ ಮೈನರ್ ಗ್ರೂವ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ, ಹೆಚ್ಚು ಹೆಚ್ಚು ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಸಹ ನಿರಂತರವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಡೈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
PS: ಪ್ರಯೋಗ ಮಾಡುವಾಗ ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರಿ, ಬಣ್ಣವನ್ನು ಮಾನವ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಬೇಕು, ಅದನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವ್ಯಕ್ತಿಯಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರಿ.

ಡೈ ವಿಧಾನ (ಎಡ) ಪ್ರೋಬ್ ವಿಧಾನ (ಬಲ)
PS: ಪ್ರಯೋಗ ಮಾಡುವಾಗ ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರಿ, ಬಣ್ಣವನ್ನು ಮಾನವ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಬೇಕು, ಅದನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವ್ಯಕ್ತಿಯಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರಿ.

SYBR ಗ್ರೀನ್ Ⅰ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಮೈನರ್ ಗ್ರೂವ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ

ತನಿಖೆ ವಿಧಾನತಕ್ಮಾನ್ ಪ್ರೋಬ್ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ಶೋಧಕವಾಗಿದೆ.ತನಿಖೆಯ 5′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು ಇರುತ್ತದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ FAM, ಮತ್ತು ತನಿಖೆಯು ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿದೆ.3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಕ್ವೆನ್ಚಿಂಗ್ ಗುಂಪು ಇದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅನುರಣನ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆಯ ತತ್ವದ ಪ್ರಕಾರ (Förster ಅನುರಣನ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆ, FRET), ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು (ದಾನಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣು) ಮತ್ತು ಕ್ವೆನ್ಚಿಂಗ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಗುಂಪು (ಸ್ವೀಕರಿಸುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅಣು) ಉತ್ಸುಕರಾದಾಗ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಅತಿಕ್ರಮಿಸಿದಾಗ (7 ದೂರವು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತದೆ) ಸ್ವೀಕಾರಕ ಅಣುವಿನ ಪ್ರತಿದೀಪಕತೆ, ಆಟೋಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, ತನಿಖೆಯು ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಮುಕ್ತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಅಖಂಡವಾಗಿದ್ದಾಗ, ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪು ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಹೊರಸೂಸುವುದಿಲ್ಲ.ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವಾಗ, ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ನಿರಂತರವಾಗಿ ಹೊಸ ಸರಪಳಿಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ.DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ 5′-3′ ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ತನಿಖೆಯನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಿಂದ ತನಿಖೆಯನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ವರದಿಗಾರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಗುಂಪನ್ನು ಕ್ವೆಂಚರ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಗುಂಪಿನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ತನಿಖೆ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಡುವೆ ಒಂದರಿಂದ ಒಂದು ಸಂಬಂಧವಿರುವುದರಿಂದ, ಪರೀಕ್ಷೆಯ ನಿಖರತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯ ದೃಷ್ಟಿಯಿಂದ ಪ್ರೋಬ್ ವಿಧಾನವು ಡೈ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ತನಿಖಾ ವಿಧಾನವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ರೋಗನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಪ್ರಶ್ನೆ: ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಎಂದರೇನು?ರಿಲೇಟಿವ್ ಕ್ವಾಂಟಿಫಿಕೇಶನ್ ಎಂದರೇನು?

ಉತ್ತರ: ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು qPCR ನಿಂದ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ 1ml ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಎಷ್ಟು HBV ವೈರಸ್‌ಗಳಿವೆ.ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣದಿಂದ ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶವು ಮತ್ತೊಂದು ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಯಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಉನ್ನತ-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ-ನಿಯಂತ್ರಿತವಾಗಿದೆ.

ಪ್ರಶ್ನೆ: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆಯೇ?
ಪ್ರಶ್ನೆ: ಮಾದರಿ ಸಂಗ್ರಹಣೆ, ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಕಾರಕಗಳು, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಬೆಳಕು-ಹರಡುವ ಉಪಭೋಗ್ಯಗಳು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆಯೇ?
ಪ್ರಶ್ನೆ: ಯಾವ ವಿಧಾನವು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಬಹುದು?

ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಕೆಳಗಿನ ಸುಧಾರಿತ ಮತ್ತು ಸುಧಾರಿತ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು ಅವುಗಳನ್ನು ವಿವರವಾಗಿ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ.
2. ಸುಧಾರಿತ ಜ್ಞಾನ

ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಪ್ರತಿವರ್ಷ ಸಾವಿರಾರು ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರಬಂಧಗಳನ್ನು ಪ್ರಕಟಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬ ವಾಸ್ತವವನ್ನು ನಾವು ಗುರುತಿಸಬೇಕು, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವು ಸಣ್ಣ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲ.

ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಯಾವುದೇ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮಾನದಂಡವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು.ಅದೇ ಜಾತಿಯ ಒಂದೇ ಜೀನ್‌ಗೆ, ಅದೇ ಸಂಸ್ಕರಣಾ ವಿಧಾನದೊಂದಿಗೆ, ಪತ್ತೆ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸಹ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬದಲಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ತಡವಾಗಿ ಬರುವವರಿಗೆ ಅದೇ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು ಕಷ್ಟವಾಗುತ್ತದೆ.ಯಾವುದು ಸರಿ ಮತ್ತು ಯಾವುದು ತಪ್ಪು ಎಂದು ನಿಮಗೆ ಯಾರಿಗೂ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ.

ಇದರರ್ಥ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಚೀಟ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಅಥವಾ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹವಲ್ಲದ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವೇ?ಇಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ನಿಖರವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ತಪ್ಪು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ವಿರುದ್ಧ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.ಒಂದು ಸಣ್ಣ ನಷ್ಟವು ಸಾವಿರ ಮೈಲುಗಳಷ್ಟು ದೂರದಲ್ಲಿದೆ.ಲೇಖನದ ಲೇಖಕರು ವಿಮರ್ಶಕರಿಂದ ಪದೇ ಪದೇ ಚಿತ್ರಹಿಂಸೆಗೊಳಗಾಗಬಹುದು.ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ನಿಯತಕಾಲಿಕದ ವಿಮರ್ಶಕರು ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಂದ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವುದು ಕಷ್ಟ.

ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಒಮ್ಮತದ ಕೊರತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ಉದ್ಯಮದಲ್ಲಿನ ಹಿರಿಯ ವಿಜ್ಞಾನಿಗಳು ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿದರು,ಈ ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸಲು ಲೇಖನದಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಅಗತ್ಯ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ಸಂಸ್ಕರಣಾ ವಿವರಗಳನ್ನು (ಅಗತ್ಯ ಡೇಟಾ ಸೇರಿದಂತೆ) ಒದಗಿಸಲು ಕೊಡುಗೆದಾರರ ಅಗತ್ಯವಿದೆ .

ಈ ವಿವರಗಳನ್ನು ಓದುವ ಮೂಲಕ ವಿಮರ್ಶಕರು ಪ್ರಯೋಗದ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಬಹುದು;ಭವಿಷ್ಯದ ಓದುಗರು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು ಅಥವಾ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಇದನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ನಂತರ ಈ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಹಿತಿ, ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮತ್ತು ಬಳಸಬಹುದಾದವು.

MIBBI (ಜೈವಿಕ ಮತ್ತು ಬಯೋಮೆಡಿಕಲ್ ತನಿಖೆಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಹಿತಿ -http://www.mibbi.org) ಅಸ್ತಿತ್ವಕ್ಕೆ ಬಂದಿತು.MIBBI ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುವ ಯೋಜನೆಯಾಗಿದೆ.ಇದು ಪ್ರಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಕಟವಾಗಿದೆ.ಈ ಯೋಜನೆಯು ಕೋಶ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ, ಮೈಕ್ರೋಅರೇ, qPCR ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿರಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ, ನಾವು ಈಗ ಚರ್ಚಿಸಲಿದ್ದೇವೆ, ಮತ್ತು ಹಸ್ತಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ಸಲ್ಲಿಸುವಾಗ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ರೀತಿಯ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಎಲ್ಲಾ ಸಮಯದಲ್ಲೂ ಒದಗಿಸಬೇಕು.

MIBBI ಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ, ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ PCR ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಎರಡು ಲೇಖನಗಳಿವೆ, ಅವುಗಳೆಂದರೆ:
·RDML (ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ PCR ಡೇಟಾ ಮಾರ್ಕಪ್ ಭಾಷೆ) - ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಡೇಟಾಕ್ಕಾಗಿ ರಚನಾತ್ಮಕ ಭಾಷೆ ಮತ್ತು ವರದಿ ಮಾಡುವ ಮಾರ್ಗದರ್ಶಿ;
·MIQE (ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಪ್ರಕಟಣೆಗಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಹಿತಿ) - ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಲೇಖನಗಳನ್ನು ಪ್ರಕಟಿಸಲು ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಹಿತಿ.
ಮೊದಲಿಗೆ, RDML, ಪರಿಭಾಷೆಯ ವಿವರಣೆಯ ಬಗ್ಗೆ ಮಾತನಾಡೋಣ.

ಪ್ರತಿಯೊಂದಕ್ಕೂ ಯಾವುದೇ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಚರ್ಚೆಯನ್ನು ಮುಂದುವರಿಸುವುದು ಅಸಾಧ್ಯ, ಅದಕ್ಕಾಗಿಯೇ ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ ನಿಯಮಗಳ ವಿವರಣೆಯು ತುಂಬಾ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.
ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪರಿಭಾಷೆಯು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಷಯವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.QIAGEN ನಮಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾರಾಂಶವನ್ನು ಮಾಡಿದೆ.ಕೆಳಗಿನವುಗಳೆಲ್ಲವೂ ಒಣಗಿವೆಸರಕುಗಳು .

ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್
ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮಾಡಿದ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಚಕ್ರ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಅಬ್ಸಿಸ್ಸಾ ಮತ್ತು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಆರ್ಡಿನೇಟ್ ಆಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.

ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು: ಬೇಸ್ಲೈನ್ ​​ಸಮತಟ್ಟಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಸ್ವಲ್ಪ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಮೇಲ್ಮುಖ ಪ್ರವೃತ್ತಿ ಇಲ್ಲ;ವಕ್ರರೇಖೆಯ ಒಳಹರಿವಿನ ಬಿಂದುವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಘಾತೀಯ ಹಂತದ ಇಳಿಜಾರು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಇಳಿಜಾರು, ಹೆಚ್ಚಿನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ;ಒಟ್ಟಾರೆ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ ಸಮಾನಾಂತರತೆಯು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ, ಇದು ಪ್ರತಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ನ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಹೋಲುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ;ಕಡಿಮೆ-ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮಾದರಿಗಳ ವರ್ಧನೆಯ ಕರ್ವ್ನ ಘಾತೀಯ ಹಂತವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ.

ಬೇಸ್ಲೈನ್ ​​(ಬೇಸ್ಲೈನ್)
ಬೇಸ್ಲೈನ್ ​​ಆರಂಭಿಕ ಚಕ್ರದ ಶಬ್ದ ಮಟ್ಟವಾಗಿದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 3 ನೇ ಮತ್ತು 15 ನೇ ಚಕ್ರದ ನಡುವೆ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗುವ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಬದಲಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ ಅಥವಾ ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವು ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ ಅದನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬೇಕಾಗಬಹುದು.

ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ರೇಖೀಯತೆಯ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನಿಂದ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಆದ್ದರಿಂದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯು ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಸೈಕಲ್ ಟಾಪ್ ಸಂಖ್ಯೆಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸೈಕಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.ಆರಂಭಿಕ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಂದ ಕಳೆಯಬೇಕಾಗಿದೆ.ವಿವಿಧ ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನ ಇತ್ತೀಚಿನ ಆವೃತ್ತಿಗಳು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಮಾದರಿಗಳಿಗಾಗಿ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಳ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.

ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲ ಕೆಲವು ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಹೆಚ್ಚು ಬದಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಸರಳ ರೇಖೆಯನ್ನು ಸಮೀಪಿಸುವುದನ್ನು ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ನಾವು ಮೊದಲ ಕೆಲವು ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ಹತ್ತಿರದಿಂದ ನೋಡಿದರೆ, ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಏನು ನಡೆಯುತ್ತಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಾವು ನೋಡುತ್ತೇವೆ.

ಹಿನ್ನೆಲೆ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ: ಅಸಮರ್ಥ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಕ್ವೆನ್ಚಿಂಗ್;ಅಥವಾ SYBR ಗ್ರೀನ್ ಬಳಕೆಯಿಂದಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು.ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ PCR ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್‌ನಿಂದ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಗಣಿತೀಯವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.

ವರದಿಗಾರ ಸಂಕೇತ
ವರದಿಗಾರ ಸಂಕೇತವು ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಸಮಯದಲ್ಲಿ SYBR ಗ್ರೀನ್ ಅಥವಾ ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಅನುಕ್ರಮ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ನಾರ್ಮಲೈಸ್ಡ್ ರಿಪೋರ್ಟರ್ ಸಿಗ್ನಲ್ (RN)
RN ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಅಳತೆ ಮಾಡಲಾದ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ಉಲ್ಲೇಖದ ವರ್ಣದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯಿಂದ ಭಾಗಿಸಿದ ವರದಿಗಾರ ವರ್ಣದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ಉಲ್ಲೇಖ ಬಣ್ಣ
ಕೆಲವು ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಗಳಲ್ಲಿ,ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ROX ಅನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇದು ತಪ್ಪಾದ ಪೈಪೆಟಿಂಗ್, ಬಾವಿಯ ಸ್ಥಾನ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಏರಿಳಿತಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ವ್ಯತ್ಯಯಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ.

ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಿತಿ (ಮಿತಿ)
ಹಿನ್ನೆಲೆ ಮೌಲ್ಯದ ಮೇಲೆ ಮತ್ತು ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನ ಪ್ರಸ್ಥಭೂಮಿ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕೆಳಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ಪತ್ತೆಯ ಲಾಗ್-ಲೀನಿಯರ್ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್‌ನ ರೇಖೀಯ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿರಬೇಕು.ಲಾಗ್-ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ ವೀಕ್ಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿಸಬೇಕು ಇದರಿಂದ ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಲಾಗ್-ಲೀನಿಯರ್ ಹಂತವನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಬಹುದಾಗಿದೆ.ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ನಲ್ಲಿ ಬಹು ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳಿದ್ದರೆ, ಪ್ರತಿ ಗುರಿಗೆ ಮಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಬೇಕು.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲ 15 ಚಕ್ರಗಳ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಂಕೇತವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಿತಿಯು ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಮೊದಲ 3 ರಿಂದ 15 ಚಕ್ರಗಳ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನಕ್ಕಿಂತ 10 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು, ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಉಪಕರಣವು ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಅದರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.

ಸೈಕಲ್ ಥ್ರೆಶೋಲ್ಡ್ (CT) ಅಥವಾ ಕ್ರಾಸಿಂಗ್ ಪಾಯಿಂಟ್ (CP)
ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಕರ್ವ್ ಮಿತಿಯನ್ನು ದಾಟುವ ಚಕ್ರ (ಅಂದರೆ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪತ್ತೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗುವ ಹಂತ).CT ಒಂದು ಭಾಗವಾಗಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ಆರಂಭಿಕ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬಹುದು.CT ಮೌಲ್ಯವು ಪ್ರತಿ ಪಿಸಿಆರ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಸೆಟ್ ಥ್ರೆಶೋಲ್ಡ್ ಅನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ ಅನುಭವಿಸಿದ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ CT ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲಾಗರಿಥಮ್ ನಡುವೆ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧವಿದೆ,ಹೆಚ್ಚಿನ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ, ಚಿಕ್ಕದಾದ CT ಮೌಲ್ಯ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯಾಗಿ.ತಿಳಿದಿರುವ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಅಬ್ಸಿಸ್ಸಾವು CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರ್ಡಿನೇಟ್ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲಾಗರಿಥಮ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಅಜ್ಞಾತ ಮಾದರಿಯ CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪಡೆಯುವವರೆಗೆ, ಮಾದರಿಯ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯಿಂದ ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬಹುದು.

ΔCT ಮೌಲ್ಯ
ΔCT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್ CT ಮೌಲ್ಯದ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್, ಮತ್ತು ಬಳಸಿದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ:
⇒ΔCT = CT (ಗುರಿ ಜೀನ್) - CT (ಅಂತರ್ಜನಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್)

ΔΔCT ಮೌಲ್ಯ
ΔΔCT ಮೌಲ್ಯವು ಆಸಕ್ತಿಯ ಮಾದರಿಯ ಸರಾಸರಿ ΔΔCT ಮೌಲ್ಯದ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ (ಉದಾ, ಪ್ರಚೋದಿತ ಕೋಶಗಳು) ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿಯ ಸರಾಸರಿ ΔΔCT ಮೌಲ್ಯ (ಉದಾ, ಉತ್ತೇಜಿಸದ ಕೋಶಗಳು).ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ಮಾದರಿ ಎಂದೂ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ:
⇒ΔΔCT = ಸರಾಸರಿ ΔCT (ಆಸಕ್ತಿಯ ಮಾದರಿ) - ಸರಾಸರಿ ΔCT (ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿ)

ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳು (ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳು)
ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್‌ಗಳಂತಹ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟಗಳು (ಹೌಸ್‌ಕೀಪಿಂಗ್ ಜೀನ್‌ಗಳು), ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವೆ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ.ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ CT ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಜೀನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸುವುದು ಗುರಿಯ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಇನ್‌ಪುಟ್ RNA ಅಥವಾ cDNA ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ (ಮೇಲಿನ ΔCT ಮೌಲ್ಯಗಳ ವಿಭಾಗವನ್ನು ನೋಡಿ).

ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಸರಿಯಾಗಿವೆಸಂಭವನೀಯ ಆರ್ಎನ್ಎ ಅವನತಿ ಅಥವಾ ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ, ಹಾಗೆಯೇ ಆರ್ಎನ್ಎ ವಿಷಯದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಚೇತರಿಕೆ ಮತ್ತು ಮಾದರಿ ನಿರ್ವಹಣೆ.ಸೂಕ್ತ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್(ಗಳನ್ನು) ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಸೂಕ್ತವಾದ ಉಲ್ಲೇಖದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು ನಾವು ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.

ಒಳ ನಿಯಂತ್ರಣ
ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮದಂತೆಯೇ ಅದೇ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸುವ ನಿಯಂತ್ರಣ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ತನಿಖೆಯೊಂದಿಗೆ (ಅಂದರೆ, ಡ್ಯುಪ್ಲೆಕ್ಸ್ PCR ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವುದು) ತನಿಖೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚದಿದ್ದಾಗ ವಿಫಲವಾದ ವರ್ಧನೆಗಳನ್ನು ತಳ್ಳಿಹಾಕಲು ಆಂತರಿಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ಮಾದರಿ
ಒಂದು ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಜೀವಕೋಶದ ರೇಖೆ ಅಥವಾ ಅಂಗಾಂಶದಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ) ಜೀನ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಲು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದ ಮಾದರಿಯು ಯಾವುದೇ ಮಾದರಿಯಾಗಿರಬಹುದು, ಆದರೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ಮಾದರಿ ಅಥವಾ ಪ್ರಯೋಗದ ಶೂನ್ಯದಿಂದ ಮಾದರಿ).

ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು
ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಿತಿಳಿದಿರುವ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರಮಾಣಗಳು.ಪ್ರೈಮರ್ ಸೆಟ್ ಅಥವಾ ಪ್ರೈಮರ್-ಪ್ರೋಬ್ ಸೆಟ್ ಸರಿಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತಿದೆಯೇ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಿಯಂತ್ರಣವಿಲ್ಲ (NTC)
ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ವರ್ಧನೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಎಲ್ಲಾ ಅಗತ್ಯ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ, ಇದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನೀರಿನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.NTC ಯ ಬಳಕೆಯು ಕಾರಕ ಮಾಲಿನ್ಯ ಅಥವಾ ವಿದೇಶಿ DNA ಯಿಂದ ಉಂಟಾದ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು, ಹೀಗಾಗಿ ಪತ್ತೆ ದತ್ತಾಂಶದ ದೃಢೀಕರಣ ಮತ್ತು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.NTC ನಿಯಂತ್ರಣದ ವರ್ಧನೆಯು ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

RT ನಿಯಂತ್ರಣವಿಲ್ಲ (NRT)
ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಉಳಿದಿರುವ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು, ಇದು ಅತ್ಯಂತ ಹಾನಿಕಾರಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು qPCR ನ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಶತ್ರುಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಅಪರಾಧಿಯಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವಾಗ, ಅದನ್ನು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪತ್ತೆಯನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಮಾತ್ರ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕು.ಎರಡು ಮಾರ್ಗಗಳಿವೆ, ಒಂದು ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳಾದ್ಯಂತ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದು, ಇನ್ನೊಂದು ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು, ಯಾವುದು ಉತ್ತಮ, ಅದನ್ನು ನಂತರ ಚರ್ಚಿಸಲಾಗುವುದು.ಎನ್ಟಿಆರ್ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಒಂದು ಮ್ಯಾಜಿಕ್ ಕನ್ನಡಿಯಾಗಿದೆ.ವರ್ಧನೆ ಇದ್ದರೆ, ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಎಂದರ್ಥ.

ಮಾನದಂಡಗಳು
ಮಾನದಂಡಗಳು ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುವ ತಿಳಿದಿರುವ ಏಕಾಗ್ರತೆ ಅಥವಾ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮಾದರಿಗಳಾಗಿವೆ.ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್‌ನ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಜೀನ್ ತುಣುಕನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗೆ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುವ ಅನುಪಾತದ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಉತ್ಪನ್ನದೊಂದಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 5 ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಇಳಿಜಾರುಗಳಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CT ಮೌಲ್ಯ ಮತ್ತು ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳಲ್ಲಿ 5 ಅಂಕಗಳನ್ನು ಎಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಲು ಬಿಂದುಗಳನ್ನು ರೇಖೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ, ಅದರ ಸಿಂಧುತ್ವವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಇಳಿಜಾರಿನ ಮೌಲ್ಯವು -3.3 ಮತ್ತು -3.8 ರ ನಡುವೆ ಬೀಳುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇತರ ಬಿಂದುಗಳಿಂದ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುವ ಅಂಕಗಳನ್ನು ತ್ಯಜಿಸಬೇಕು.ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ ತರಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.

ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ ತರಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.

ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಇಳಿಜಾರು
ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್‌ನ ಇಳಿಜಾರು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
· -3.322 ರ ಇಳಿಜಾರು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 1 ಅಥವಾ 100% ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ PCR ಉತ್ಪನ್ನದ ಪ್ರಮಾಣವು ದ್ವಿಗುಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.
-3.322 (ಉದಾ, –3.8) ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇಳಿಜಾರು PCR ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ
·-3.322 (ಉದಾ, –3.0) ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಇಳಿಜಾರು ಪಿಸಿಆರ್ ದಕ್ಷತೆಯು 100% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿದೆ, ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಒಂದು ಚಕ್ರವು ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನಕ್ಕಿಂತ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು ಹೇಗೆ ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ?ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ರೇಖಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ, ಅಂದರೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಇದೆ.

ಕರಗುವ ವಕ್ರರೇಖೆ
qPCR ವರ್ಧನೆಯು ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, PCR ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉಷ್ಣತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ, ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಉತ್ಪನ್ನವು ಕ್ರಮೇಣ ಕರಗುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ.ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನ (Tm) ತಲುಪಿದಾಗ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಕರಗುತ್ತವೆ.ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ತೀವ್ರವಾಗಿ ಇಳಿಯುತ್ತದೆ.ವಿಭಿನ್ನ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ವಿಭಿನ್ನ Tm ಮೌಲ್ಯಗಳು ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ PCR ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು.

ಕರಗುವ ವಕ್ರರೇಖೆ (ಉತ್ಪನ್ನ ವಕ್ರರೇಖೆ)
ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಗರಿಷ್ಠ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ, ಇದು PCR ಉತ್ಪನ್ನ ತುಣುಕುಗಳ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಅಂತರ್ಬೋಧೆಯಿಂದ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ.ಕರಗುವ ಉಷ್ಣತೆಯು DNA ತುಣುಕಿನ Tm ಮೌಲ್ಯವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, DNA ತುಣುಕಿನ Tm ಮೌಲ್ಯದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಕೆಲವು ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಬಹುದು, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ತುಣುಕು ಗಾತ್ರ, GC ವಿಷಯ, ಇತ್ಯಾದಿ. ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ನಮ್ಮ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ತತ್ವಗಳ ಪ್ರಕಾರ,ವರ್ಧಿತ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದವು 80-300bp ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನವು 80 ° C ಮತ್ತು 90 ° C ನಡುವೆ ಇರಬೇಕು.

ಕರಗುವ ವಕ್ರರೇಖೆಯ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ: 80°C-90°C ನಡುವೆ ಮುಖ್ಯ ಶಿಖರವು ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡರೆ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಪರಿಪೂರ್ಣವಾಗಿದೆ ಎಂದರ್ಥ;ಮುಖ್ಯ ಶಿಖರವು 80 ° C-90 ° C ನಡುವೆ ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡರೆ ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಶಿಖರಗಳು 80 ° C ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಕಂಡುಬಂದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ಮೂಲತಃ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅದನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು ನೀವು ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಬಹುದು;ಮುಖ್ಯ ಶಿಖರವು 80 ° C-90 ° C ನಡುವೆ ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡರೆ ಮತ್ತು ತಾಪಮಾನವು ಹೆಚ್ಚಾದಾಗ ವಿವಿಧ ಶಿಖರವು ಮತ್ತೆ ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡರೆ, ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ DNA ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಯೋಗದ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ DNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.

ಸಹಜವಾಗಿ, ಇನ್ನೂ ಕೆಲವು ಅಸಹಜ ಸನ್ನಿವೇಶಗಳಿವೆ, ಅದನ್ನು ಕೆಳಗೆ ಒಂದೊಂದಾಗಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಗುವುದು.
3. ಸುಧಾರಿತ ಜ್ಞಾನ

qPCR ಮಾಡಲು, ನಾನು MIQE ಎಂದು ಹೇಳಬೇಕು,ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಹಿತಿಪ್ರಕಟಣೆಗಾಗಿಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್ಪ್ರಯೋಗಗಳು - ನೈಜ ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಕುರಿತು ಲೇಖನಗಳನ್ನು ಪ್ರಕಟಿಸಲು ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಹಿತಿಪ್ರಯೋಗಗಳು.ಪ್ರತಿಯೊಬ್ಬರ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಸರಳಗೊಳಿಸುವ ಸಲುವಾಗಿ, ನಾವು ಪ್ರಮುಖ ವಿಷಯವನ್ನು ಸರಳಗೊಳಿಸುತ್ತೇವೆ.

ನೀವು ಇಂಟರ್ನೆಟ್‌ನಲ್ಲಿ MIQE ನ ಮೂಲ ಪಠ್ಯವನ್ನು ಹುಡುಕಬಹುದು ಮತ್ತು ಅತ್ಯಂತ ಮುಖ್ಯವಾದ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಅದುಲೇಖನವನ್ನು ಪ್ರಕಟಿಸುವಾಗ ಒದಗಿಸಬೇಕಾದ ಡೇಟಾ ಪರಿಶೀಲನಾಪಟ್ಟಿ .

ಈ ವಿವರಗಳನ್ನು ಓದುವ ಮೂಲಕ ವಿಮರ್ಶಕರು ಪ್ರಯೋಗದ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಬಹುದು;ಭವಿಷ್ಯದ ಓದುಗರು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು ಅಥವಾ ಸುಧಾರಿಸಲು ಇದನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.
ಈ ಪಟ್ಟಿಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಪಟ್ಟಿಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ E ಅಥವಾ D ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಅಂಶವಾಗಿದೆ.ಅದರ ಅರ್ಥವೇನು?ಇ: ಅಗತ್ಯ ಮಾಹಿತಿ (ಸಲ್ಲಿಸಬೇಕು);ಡಿ: ಅಪೇಕ್ಷಣೀಯ ಮಾಹಿತಿ (ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ಒದಗಿಸಿ).

MIQE (1)-ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸ
ಪದವಿ ಶಿಕ್ಷಣವನ್ನು ಮುಗಿಸಿದ ನಂತರ ತಮ್ಮ ರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಿದ ಅನೇಕ ಕೊಳಕುಗಳಿಗೆ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಹೇಗೆ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದು, ತಮ್ಮ ನೋಟ್‌ಬುಕ್‌ಗಳನ್ನು ತೆರೆಯುವುದು ಮತ್ತು ಶಿಕ್ಷಕರು ಏನು ಮಾಡಬೇಕೆಂದು ಹೇಳಬೇಕೆಂದು ತಿಳಿದಿಲ್ಲ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸವು ಕಠಿಣವಾಗಿರಲಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪತ್ರಿಕೆಯ ಸಂಪಾದಕೀಯ ವಿಭಾಗವು ಈ ಚಿತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತು ಆ ಚಿತ್ರವನ್ನು ಮಾಡಲು ಬಯಸಿದೆ ಎಂದು ಹೇಳಿದರು, ಆದ್ದರಿಂದ ಅವರು ಅದನ್ನು ದಿಗ್ಭ್ರಮೆಗೊಳಿಸಿದರು.ಕೊಳಕುಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸುವುದು ಹೀಗೆ!

ಮನೆಗೆ ಹತ್ತಿರ, ಪ್ರಯೋಗದ ಮೊದಲ ತತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದುಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ತರ್ಕದ ಕಠಿಣತೆ.ಅತ್ಯಂತ ಮೂಲಭೂತ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸ, ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸದ ಬಗ್ಗೆ ಅತ್ಯಂತ ಮುಖ್ಯವಾದ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಗುರಿ ಮಾದರಿ, ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿ (ನಿಯಂತ್ರಣ) ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ಹೊಂದಿಸುವುದು, ಇದರಿಂದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಬಹುದು, ಹೋಲಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಮನವರಿಕೆ ಮಾಡಬಹುದು.

ಗುರಿ ಮಾದರಿಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ನಮಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿಯಾವುದೇ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಇಲ್ಲದ ಮಾದರಿಯಾಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಾಡು ಪ್ರಕಾರ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳುಬಹಳ ಮುಖ್ಯವಾಗಿವೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಮನವೊಲಿಸುವ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಮೂರಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಇರಬೇಕು.ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿ ಎಂದರೇನು ಮತ್ತು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಎಂದರೇನು ಎಂದು ಗುರುತಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ.

ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು: ವಿಭಿನ್ನ ವಸ್ತುಗಳೊಂದಿಗೆ (ಸಮಯ, ಸಸ್ಯಗಳು, ಬ್ಯಾಚ್‌ಗಳು, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಫಲಕಗಳು) ಮಾಡಿದ ಅದೇ ಪರಿಶೀಲನಾ ಪ್ರಯೋಗ.

ಜೈವಿಕ ನಕಲು
ಕಾಳುಮೆಣಸಿನ ಕೀಟನಾಶಕ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳೋಣ.ನಾವು ಎಬಿಸಿಯ ಮೂರು ಸಸ್ಯಗಳ ಮೇಲೆ ಕೀಟನಾಶಕಗಳನ್ನು ಸಿಂಪಡಿಸಲು ಬಯಸುತ್ತೇವೆ, ನಂತರ ಎಬಿಸಿಯ ಮೂರು ಸಸ್ಯಗಳು ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಅವು ವಿಭಿನ್ನ ವಸ್ತುಗಳೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಿದ ಒಂದೇ ಪರಿಶೀಲನಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳಾಗಿವೆ.ಆದರೆ ಪ್ರಯೋಗವಾಗಿ, ನಿಯಂತ್ರಣವು ಖಂಡಿತವಾಗಿಯೂ ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ನಾವು ಸಸ್ಯ A ಯ ಒಂದು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಸ್ಯ A ಯ ಶಾಖೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದನ್ನು ಸಿಂಪಡಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಸ್ಯ A ಯ ಇತರ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಸಿಂಪಡಿಸಬಾರದು.ಬಿ ಮತ್ತು ಸಿ ಗಾಗಿ ಅದೇ ರೀತಿ ಮಾಡಿ.

ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು (ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು): ಇದು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ದೋಷಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರಯೋಗವಾಗಿದೆ, ಇದು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ಅದೇ ವಸ್ತುವಿನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನಕಲಿ ರಂಧ್ರವಾಗಿದೆ.ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳು ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳೆರಡೂ ಗುರಿಯ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ ಪ್ರತಿಕೃತಿ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು (ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು) ಹೊಂದಿರಬೇಕು.

ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆ
ಕೀಟನಾಶಕಗಳಿಂದ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕಾಳುಮೆಣಸನ್ನು ಮತ್ತೊಮ್ಮೆ ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ.ಸಸ್ಯ A ಯ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿಗೆ, ನಾವು ಅದರ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಾಗಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ 1, 2, ಮತ್ತು 3 ರ ಮೂರು PCR ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ ನಂತರ ಸರಾಸರಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಸಸ್ಯದ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ A ಗುಂಪುಗಳನ್ನು ಸಹ ಅದೇ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅದೇ ರೀತಿ, ಬಿ ಮತ್ತು ಸಿ ಸಸ್ಯಗಳಿಗೆ ಅದೇ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಮಾಡಿ.ಇದು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗಿದೆ.

ಎಂಬುದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿಅಂಕಿಅಂಶಗಳನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುವುದು ಜೈವಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ವಿದ್ಯಮಾನಗಳಿವೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸುವುದು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹವಾಗಿಸಲು, ಅಂದರೆ, ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವಂತೆ ಅವುಗಳ ಸರಾಸರಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುವ ಮೂಲಕ ದೋಷಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು.

ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು-NTC ಮತ್ತು NRT
NTC (ನೋ-ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಿಯಂತ್ರಣ), ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಇಲ್ಲದ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತು ಕಲುಷಿತಗೊಂಡಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ನೀರನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಿದ್ದರೆ, ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಮಾಲಿನ್ಯವು ಸಂಭವಿಸಿದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ಈ ಮಾಲಿನ್ಯಗಳು ಇವುಗಳಿಂದ ಬರುತ್ತವೆ: ಅಶುದ್ಧ ನೀರು, ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ DNA ಹೊಂದಿರುವ ಅನರ್ಹ ಕಾರಕಗಳು, ಪ್ರೈಮರ್ ಮಾಲಿನ್ಯ, ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ಉಪಕರಣಗಳ ಮಾಲಿನ್ಯ, ಏರೋಸಾಲ್ ಮಾಲಿನ್ಯ, ಇತ್ಯಾದಿ, RNase ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಬಳಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.ಏರೋಸಾಲ್ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವುದು ಅತ್ಯಂತ ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ.ನಿಮ್ಮ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯವು ಹೊಗೆಯಂತಿದೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಿ, ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.

NRT (ನೋ-ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್), ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಇಲ್ಲದ ನಿಯಂತ್ರಣ, ರಿವರ್ಸ್ ಅಲ್ಲದ RNAಯನ್ನು ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು gDNA ಅವಶೇಷಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿದೆ.

ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾಡುವಾಗ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ನಂತರ cDNA ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಮೂಲಕ RNA ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದಾಗ ಜಿಡಿಎನ್‌ಎ ಶೇಷವು ಇದ್ದರೆ, ಅದು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ದೋಷಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಪಡೆದ ನಿಜವಾದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಜಿಡಿಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ.ಒಟ್ಟಾರೆ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ, ಕೇವಲ cDNA ಅಲ್ಲ, RNA ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ gDNA ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.

MIQE (2)-ಮಾದರಿ ಮಾಹಿತಿ
ಮಾದರಿ ಮಾಹಿತಿ ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವುದು ಎಂದರೆ ನಾವು qPCR ಕುರಿತು ಲೇಖನವನ್ನು ಪ್ರಕಟಿಸಿದಾಗ, ನಾವು ಮಾದರಿ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ವಿವರಿಸಬೇಕು, ಇದು ಲೇಖನದ ಅನಿವಾರ್ಯ ಭಾಗವಾಗಿದೆ.ಅಂತೆಯೇ, ನಾವು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸುವಾಗ, ಮಾದರಿಗಳ ಸಿಂಧುತ್ವವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ನಾವು ನಮ್ಮ ಸ್ವಂತ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು.

ಮಾದರಿಯ ವಿವರಣೆಯು ಕೇವಲ ಫಲಿತಾಂಶವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಇಡೀ ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡ ವಸ್ತುಗಳಿಗೆ ನಾವು ಹೆಚ್ಚು ಗಮನ ಹರಿಸಬೇಕು.

ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತುಗಳ ಆಯ್ಕೆ
ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳು - ತಾಜಾ ರಕ್ತವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿ, 4 ಗಂಟೆಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ.ಜೀವಕೋಶದ ಮಾದರಿಗಳು - ಹುರುಪಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ತಾಜಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಅಂಗಾಂಶ - ತಾಜಾ, ಬಲವಾಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತಿರುವ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಆರಿಸಿ.ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶ - ತಾಜಾ, ಯುವ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಆರಿಸಿ.

ಈ ಕೆಲವು ವಾಕ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ಪ್ರಮುಖ ಪದವಿದೆ ಎಂದು ನೀವು ಗಮನಿಸಿರಬೇಕು: ತಾಜಾ .
ಮೇಲಿನ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, ಮಾರುಕಟ್ಟೆಯಲ್ಲಿ ಉತ್ತಮವಾದ, ವೆಚ್ಚ-ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರವಾದ ಕಿಟ್ ಫೋರ್ಜೀನ್ ಕಿಟ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಸುಲಭವಾಗಿ ಅವುಗಳ DNA ಮತ್ತು RNA ಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಬಹುದು.

ರಕ್ತದ DNA ಮಿನಿ ಕಿಟ್

ಸೆಲ್ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಕಿಟ್

ಅನಿಮಲ್ ಟೋಟಲ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಐಸೋಲೇಶನ್ ಕಿಟ್

ಸಸ್ಯದ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಕಿಟ್

ಪ್ಲಾಂಟ್ ಟೋಟಲ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಐಸೋಲೇಶನ್ ಕಿಟ್ ಪ್ಲಸ್

ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡಿಎನ್ಎ ಐಸೋಲೇಶನ್ ಕಿಟ್

ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತುಗಳ ಸಂಗ್ರಹಣೆ
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಅನುಮತಿಸಿದರೆ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮಾದರಿಯ ನಂತರ ತಕ್ಷಣವೇ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದ ಅನೇಕ ಸ್ನೇಹಿತರಿದ್ದಾರೆ, ಮತ್ತು ಕೆಲವರು ಮಾದರಿಗಾಗಿ ಮೈದಾನಕ್ಕೆ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕ ತೊಟ್ಟಿಗಳನ್ನು ಕೊಂಡೊಯ್ಯಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.

ಈ ರೀತಿಯ ಕಷ್ಟಪಟ್ಟು ದುಡಿಯುವ ಸ್ನೇಹಿತರಿಗೆ, ನೀವು ಕಾರಕ ಉಪಭೋಗ್ಯವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಮಾತ್ರ ನಾನು ಹೇಳಬಲ್ಲೆ.ಈಗ ಅನೇಕ ಕಾರಕ ಉಪಭೋಗ್ಯ ಕಂಪನಿಗಳು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಲ್ಲ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ನೀವು ಅವುಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು.ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಶೇಖರಣಾ ವಿಧಾನವೆಂದರೆ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕ ಶೇಖರಣೆಯಾಗಿದ್ದು, ಸಾಗಿಸಲು ಸುಲಭವಾದ ಸಣ್ಣ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕ ತೊಟ್ಟಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮತ್ತೆ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಕ್ಕೆ ತಂದ ನಂತರ, ಅದನ್ನು -80 ° C ರೆಫ್ರಿಜರೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.

ಆರ್ಎನ್ಎ ಒಳಗೊಂಡ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ, ಆರು ಪದಗಳ ತತ್ವವನ್ನು ಅನುಸರಿಸಬೇಕು:ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನ, ಕಿಣ್ವಗಳಿಲ್ಲ,ಮತ್ತುವೇಗವಾಗಿ .

ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಸುಲಭ;ಕಿಣ್ವಗಳಿಲ್ಲದೆ, RNase ನಾವು ವಾಸಿಸುವ ಪ್ರಪಂಚದಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲೆಡೆ ಇರುತ್ತದೆ (ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ನೀವು HIV ನಿಂದ ಕೊಲ್ಲಲ್ಪಡುತ್ತೀರಿ), ಆದ್ದರಿಂದ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಮಾಡುವಾಗ RNase ಅನ್ನು ಹೇಗೆ ತಪ್ಪಿಸುವುದು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯವಾದ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯಾಗಿದೆ;ವೇಗವಾಗಿ,ಜಗತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಕುಂಗ್ ಫೂ ಅನ್ನು ಮುರಿಯಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ವೇಗವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಮುರಿಯಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.

ಆದ್ದರಿಂದ, ಒಂದು ಅರ್ಥದಲ್ಲಿ, ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಮಯ ಕಡಿಮೆ, ಕಿಟ್ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ಏಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆಪೂರ್ವಜನ್ಯಕಿಟ್ ವೇಗವನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಅವರು ಅದನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ತಿಳಿದಿದ್ದಾರೆ.

PS: ಕೆಲವು ಹುಡುಗಿಯರು ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಬಹಳ ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಮಾಡುತ್ತಾರೆ, ಆದರೆ ಅವರು ಹಲವಾರು ವರ್ಷಗಳ ಕೆಲಸದ ನಂತರ ಸ್ಲ್ಯಾಮ್ ಡಂಕ್ನಷ್ಟು ಉತ್ತಮವಾಗಿಲ್ಲ.ದೇವರಿಗೆ ಅನ್ಯಾಯವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಅವರು ಭಾವಿಸುತ್ತಾರೆ, ಇತರರ ಬಗ್ಗೆ ದೂರು ನೀಡುತ್ತಾರೆ ಮತ್ತು ಜೀವನವನ್ನು ಹುಡುಕುತ್ತಾರೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಅವಳು ಅದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲಿಲ್ಲ.ಅವರು ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ರಕ್ಷಿಸಲಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಸ್ಲ್ಯಾಮ್ ಡಂಕ್ ಆಟಗಾರನು ವೇಗವುಳ್ಳವನಾಗಿದ್ದನು.ಪ್ರಯೋಗ ಮಾಡುವಾಗ ಸ್ಲಾಮ್ ಡಂಕ್ ಅನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ, ಐದು ಬಾರಿ ಮತ್ತು ಎರಡು ವಿಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಮುಗಿಸುತ್ತೇನೆ ಎಂದು ಅವರು ಭಾವಿಸಿದ್ದರು, ಆದರೆ ಅವರು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಾಡಿದರು.

ಸೂಚನೆ: ನಿಧಾನವಾಗಿ, RNase ಆಕ್ರಮಣದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅವಕಾಶಗಳು.ವೇಗವಾಗಿರಲು ನಿಮ್ಮನ್ನು ಹೇಗೆ ತರಬೇತಿ ಮಾಡುವುದು?ಯಾವುದೇ ಮಾರ್ಗವಿಲ್ಲ, ಹೆಚ್ಚು ಅಭ್ಯಾಸ ಮಾಡಿ.

ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಮಾದರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಹಿತ್ಯವನ್ನು ಓದಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಇನ್ನೂ ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ.ಮಾದರಿ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು ಶೇಖರಣಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಾಗಿ, MIQE ಅದನ್ನು ಕಾಗದದಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಬರೆಯಬೇಕು, ಆದ್ದರಿಂದ ವಿಮರ್ಶಕರು ಕಾಗದದ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನಿಮ್ಮ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲು ದಿಗ್ಭ್ರಮೆಗೊಂಡ ಯುವಕರಿಗೆ ಇದು ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದ್ದರೂ, ಅವು ಉನ್ನತ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿವೆ.ನೀವು ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಜಗತ್ತನ್ನು ಉರುಳಿಸಬಹುದು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, SARS ಅನ್ನು ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಬಿಕ್ಕಟ್ಟಾಗಿ ಮಾಡುವುದು ಅಥವಾ 1.3 ಶತಕೋಟಿ ಜನರನ್ನು ಉಳಿಸಲು ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಅಕ್ಕಿಯನ್ನು ತಯಾರಿಸುವುದು.ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವು ರಾಸಾಯನಿಕ ಪ್ರಯೋಗವಾಗಿದೆ, ಅವನ ಡಿಕ್ ತರಹದ ನೋಟವನ್ನು ನೋಡುವ ಮೂಲಕ ನಿಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಬಗ್ಗೆ ನೀವು ಎಷ್ಟು ಹೆಮ್ಮೆಪಡುತ್ತೀರಿ ಎಂಬುದನ್ನು ನೀವು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.ಅದನ್ನು ಮರೆತುಬಿಡಿ, ಅವನನ್ನು ಕಪ್ಪು ಮಾಡಬೇಡಿ.

MIQE (3) - ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ.
ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಒಂದು ದೊಡ್ಡ ಘಟನೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತವೆ.ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ MIQE ನ ವಿಷಯವನ್ನು ನಕಲಿಸೋಣ.

ಈ ಫಾರ್ಮ್ ಅನ್ನು ನೋಡಿದರೆ, ನೀವು ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಉಳಿಯಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ರೂಪವು ಒಂದು ಸಿದ್ಧಾಂತವಾಗಿದೆ.ಉನ್ನತ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಯಾಗಲು, ಏಕೆ ಎಂದು ನೀವು ಕೇಳಬೇಕು.ಈ ಕೋಷ್ಟಕದ ಅಗತ್ಯ ವಿಷಯವೆಂದರೆ: ಮುಂದುವರಿಸುಆರ್ಎನ್ಎಯ ಶುದ್ಧತೆ, ಸಮಗ್ರತೆ, ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಮಾಣ .

ನ ಮೊದಲ ಭಾಗಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಅಥವಾ ಉಪಕರಣವು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಹಂತವಾಗಿದೆ.ಹೊರತೆಗೆಯಲು ನೀವು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ (ಸುಧಾರಿತ, ದಯವಿಟ್ಟು ಖರೀದಿಗಾಗಿ ನನ್ನನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ), ನೀವು ಉಪಕರಣದ ಮಾದರಿ ಹೆಸರನ್ನು ಸೂಚಿಸಬೇಕು.

ಕಿಟ್‌ನ ಹೆಸರು ಮತ್ತು

ಬದಲಾವಣೆಯ ವಿವರಗಳಿಗಾಗಿ ಯಾವ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ, ಯಾವ ವಿಶೇಷ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಯಾವ ವಿಶೇಷ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ವಿವರಿಸಬೇಕು ಇದರಿಂದ ಇತರರು ನಿಮ್ಮ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಬಹುದು.

ಕೆಲವರು ವಿಶೇಷ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯುವಾಗ ಕೆಲವು ವಿಶೇಷ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತಾರೆ, ಇದು ತಮ್ಮ ರಹಸ್ಯ ಅಸ್ತ್ರ ಎಂದು ಭಾವಿಸಿ ಇತರರಿಗೆ ಹೇಳಬೇಡಿ.ಅದನ್ನು ಗೌಪ್ಯವಾಗಿಟ್ಟುಕೊಂಡು, ನಿಮ್ಮ ಲೇಖನವನ್ನು ಹೊಳೆಯುವಂತೆ ಮಾಡುವ ಅವಕಾಶವನ್ನೂ ಅವರು ಕಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತಾರೆ.ಜಾಣತನ ಬೇಡ, ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ದೇಶದ ಹಿರಿಯ ಝಾಂಗ್ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಾಮಾಣಿಕವಾಗಿರಬೇಕು, ನೀವು ಬುದ್ಧಿವಂತರಾಗಬೇಕಾದರೆ, ಲೇಖನವು ನಿಮ್ಮನ್ನು ಮೂರ್ಖರನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಕಿಟ್ನ ಉತ್ಪನ್ನ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ನೆನಪಿನಲ್ಲಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳಬೇಕುನೀವು ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಆದೇಶಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ಲೇಖನವನ್ನು ಬರೆಯುವಾಗ.ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಎರಡು ಸಂಖ್ಯೆಗಳಿರುತ್ತವೆ: ಕ್ಯಾಟ್-ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ (ಉತ್ಪನ್ನ ಸಂಖ್ಯೆ, ಲೇಖನ ಸಂಖ್ಯೆ), ಲಾಟ್-ಉತ್ಪನ್ನದ ಬಹಳಷ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆ (ಉತ್ಪನ್ನವು ಯಾವ ಬ್ಯಾಚ್‌ನಿಂದ ಬಂದಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸೂಚಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ).

ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಆದೇಶಿಸುವಾಗ CAS ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ನಾನು ಅದನ್ನು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಜನಪ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತೇನೆ.CAS ಸಂಖ್ಯೆಯು ಅಮೇರಿಕನ್ ಕೆಮಿಕಲ್ ಸೊಸೈಟಿಯು ಪ್ರತಿ ಹೊಸ ರಾಸಾಯನಿಕ ಔಷಧಕ್ಕೆ ನೀಡಿದ ಸಂಖ್ಯೆಯಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಮೂರು ಸಂಖ್ಯೆಗಳನ್ನು ಡ್ಯಾಶ್ ಮೂಲಕ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ರುಶುಯಿ ಅವರ CAS ಸಂಖ್ಯೆ: 7732-18-5.ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಹು ಅಲಿಯಾಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಆದರೆ CAS ಸಂಖ್ಯೆಯು ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಔಷಧಿಯನ್ನು ಆರ್ಡರ್ ಮಾಡುವಾಗ, ನೀವು ಮೊದಲು ಅದರ CAS ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು.

ಮನೆಯ ಹತ್ತಿರ, ನಾವು ಈ ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಏಕೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ವಿವರಿಸಬೇಕು?ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಇದು ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವುದು.ಉಪಕರಣಗಳು ಮತ್ತು ಕಿಟ್‌ಗಳ ಬಳಕೆಯು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಮಾಣವು ದೊಡ್ಡದಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಕಿಟ್ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪಡೆಯಬಹುದು.

DNase ಅಥವಾ RNase ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ವಿವರಗಳು
ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಪ್ರಮುಖ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟುವುದು, ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯವಿದ್ದರೆ ಪ್ರಯೋಗ ಮಾಡಬೇಡಿ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ನೀವು ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಿದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೇಳುವುದು ಕಡ್ಡಾಯವಾಗಿದೆ.ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರದಿಂದ ನಿರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ.

ಆರ್ಎನ್ಎ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಡಿಎನ್‌ಎ ತೆಗೆಯುವ ವಿಧಾನವೆಂದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆದ ನಂತರ ಡಿನೇಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡುವುದು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಹಳೆಯ ವಿಧಾನಗಳಾಗಿವೆ.ವಾಣಿಜ್ಯ RNA ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಕಿಟ್‌ಗಳು DNase ಅನ್ನು ಸೇರಿಸದೆಯೇ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ DNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, Foregene ನಿಂದ ಕಿಟ್‌ಗಳ ಸರಣಿ.

ಸೂಚನೆ: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ತೆಗೆಯುವುದು ತುಂಬಾ ಅಪಾಯಕಾರಿಯಾದ ದ್ವಿಮುಖದ ಕತ್ತಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅವನತಿಯ ಅಪಾಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ, ಇದು ಆರ್ಎನ್ಎ ಇಳುವರಿ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯ ನಡುವಿನ ವ್ಯಾಪಾರವಾಗಿದೆ.

ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಸಿಲಿಕಾ-ಆಧಾರಿತ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಕಾಲಮ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ DNase ಪ್ರಮಾಣವು ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ DNase ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು.ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ ಮಾಡದ DNase ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಜೀರ್ಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಇದು ವ್ಯಾಪಾರಿಯ ತಾಂತ್ರಿಕ ಮಟ್ಟದ ಪರೀಕ್ಷೆಯಾಗಿದೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, ಡಿಎನ್‌ಎಸೆ ಇಲ್ಲದೆ ಡಿಎನ್‌ಎ ತೆಗೆಯಬಹುದು ಎಂದು ಹೆಮ್ಮೆಪಡುವ ಇನ್ನೂ ಹೆಚ್ಚು ವಿಲಕ್ಷಣ ವ್ಯಾಪಾರಿಗಳು ಇದ್ದಾರೆ.ಡಿಎನ್‌ಎಸೆ ಇಲ್ಲದೆ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದು ಎಂದು ಬಡಾಯಿ ಕೊಚ್ಚಿಕೊಳ್ಳುವ ಯಾರಾದರೂ ಗೂಂಡಾ ಎಂದು ಹೇಳಬಹುದು.ಡಿಎನ್ಎ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾದ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ರಚನೆಯಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಮಾತನಾಡುವ ಮತ್ತು ನಗುವ ಮೂಲಕ ಅಳಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

ಮಾಲಿನ್ಯದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ
ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ವಿಧಾನ: ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಪತ್ತೆ, 1% ಅಗರೋಸ್, 6V/cm, 15 ನಿಮಿಷ, ಲೋಡ್ 1-3 ul

ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ UV ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಬಳಸಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.OD260, OD280 ಮತ್ತು OD230 ನ ಮೂರು ಮೌಲ್ಯಗಳ ಅರ್ಥವನ್ನು ನಾನು ಮೊದಲು ಜನಪ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತೇನೆ.
·OD260nm: ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಅತ್ಯಧಿಕ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಶಿಖರದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ತರಂಗಾಂತರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಅಳತೆ ಮೌಲ್ಯವು 0.1 ರಿಂದ 1.0 ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ.ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ವ್ಯಾಪ್ತಿಯೊಳಗೆ ತರಲು ಮಾದರಿಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಅಥವಾ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿ.
·OD280nm: ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಫೀನಾಲಿಕ್ ಪದಾರ್ಥಗಳ ಅತ್ಯಧಿಕ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಶಿಖರದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ತರಂಗಾಂತರವಾಗಿದೆ.
·OD230nm: ಇದು ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ಅತ್ಯಧಿಕ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಶಿಖರದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ತರಂಗಾಂತರವಾಗಿದೆ.

ಮುಂದೆ, ಪ್ರತಿ ಸೂಚಕದ ಪಾತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಮಾತನಾಡೋಣ.A260 ಗಾಗಿ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಇದನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ಯಾವಾಗ OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

ಶುದ್ಧತೆಗಾಗಿ, ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನೋಡುವ ಅನುಪಾತಗಳನ್ನು ನೋಡಬೇಕು: OD260/280 ಮತ್ತು OD260/230.
ಶುದ್ಧ DNA: OD260/280 ಸರಿಸುಮಾರು 1.8 ಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಇದು 1.9 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಇದು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 1.6 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಫೀನಾಲ್ ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಶುದ್ಧ ಆರ್ಎನ್ಎ: 1.7
·OD260/230: ಅದು DNA ಅಥವಾ RNA ಆಗಿರಲಿ, ಉಲ್ಲೇಖ ಮೌಲ್ಯವು 2.5 ಆಗಿದೆ.ಇದು 2.0 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಸಕ್ಕರೆ, ಉಪ್ಪು ಮತ್ತು ಸಾವಯವ ಪದಾರ್ಥಗಳ ಮಾಲಿನ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.

ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆ

ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವುದು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, 28S ಮತ್ತು 18S RNA ನಡುವಿನ ಹೊಳಪು ಎರಡು-ಪಟ್ಟು ಸಂಬಂಧವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು RNA ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಜೆಲ್ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಮಾಡುವುದು ಅವಶ್ಯಕ.ಮೂರನೇ ಬ್ಯಾಂಡ್ 5S ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡಾಗ, ಅಕಶೇರುಕಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಆರ್ಎನ್ಎ ಕ್ಷೀಣಿಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿದೆ ಎಂದರ್ಥ.

ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ ಡೇಟಾ: ಮೇಲಿನ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಇನ್ನೂ ಕೆಲವು ಸುಧಾರಿತ ಸಾಧನ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಎಕ್ಸ್‌ಪೀರಿಯನ್ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ನ ಆರ್‌ಕ್ಯೂಐ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಇದು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅಗೋಚರವಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಿಸಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್ ನಡುವಿನ ಹೋಲಿಕೆಯಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿ ಸಂರಕ್ಷಣೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಇತ್ಯಾದಿ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ.

ಗುರಿಯ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್ ನಡುವಿನ ಸಮತೋಲನದ ಮೇಲೆ ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯು ಹೇಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಿಂದ ಸುಲಭವಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು.ಅವನತಿಯು ಜೀನ್ ಅಪೂರ್ಣತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ ಅಪೂರ್ಣತೆ ಅಥವಾ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನ ಅಪೂರ್ಣತೆಯಾಗಿರಬಹುದು, ಇದು ಡೇಟಾದ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ.

ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರವು ನಿಜವಾಗಿರಬಾರದು

ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪರೀಕ್ಷೆ (ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆ ಅಥವಾ ಇತರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆಯೇ)

ಈ ಅಂಕಿ ಅಂಶವನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಐದು ವಕ್ರರೇಖೆಗಳ Ct ಮೌಲ್ಯಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿವೆ.ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳ ನಡುವಿನ CT ಮೌಲ್ಯಗಳ ವಿತರಣೆಯು ಅಸಮವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು Ct ಮೌಲ್ಯಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ವಿಳಂಬವಾಗುತ್ತವೆ, ಇದು PCR ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಸಂದರ್ಭವಾಗಿದೆ.

ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶ: ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ನಾವು ತಪ್ಪು ಕಲ್ಪನೆಗಳನ್ನು ತ್ಯಜಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ಸರಿಯಾದದನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಬೇಕು.

ತಪ್ಪು ಕಲ್ಪನೆಯೆಂದರೆ: ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯು ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಅನುಸರಿಸುತ್ತದೆ, ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪಡೆದಷ್ಟೂ ಉತ್ತಮ ಎಂದು ಭಾವಿಸುತ್ತಾರೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ನಾವು ಕ್ವಾಂಟಿಫಿಕೇಶನ್ ಮಾಡುವಾಗ, ಜೀನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿರದಿದ್ದರೆ, ನಮಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ.ನೀವು ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರಮಾಣವು ಸಾಕಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚು.

ಸರಿಯಾದ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯು:ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಶುದ್ಧತೆ, ಸಮಗ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಬೇಕು.ಶುದ್ಧತೆಯು ನಂತರದ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಡೇಟಾವು DNA ಯಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು.ಸಮಗ್ರತೆಯು ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖಗಳ ಸಮತೋಲನವನ್ನು ಖಾತ್ರಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಸ್ಥಿರತೆಯು ಸ್ಥಿರ ಮಾದರಿ ಲೋಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಖಾತ್ರಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.

MIQE (4) - ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ
ತಪ್ಪು ಕಲ್ಪನೆ: ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾದರಿ ಪರಿಮಾಣದ ಅನ್ವೇಷಣೆ.
ಸರಿಯಾದ ಪರಿಕಲ್ಪನೆ: ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಿಸದೆಯೇ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು (ಸ್ಥಿರತೆ) ಮುಂದುವರಿಸಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್‌ನ ದಕ್ಷತೆಯು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಎಮ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ನಿಜವಾಗಿಯೂ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.
ನಾವು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರದೊಂದಿಗೆ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ:

ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ, ನಿಜವಾಗುವುದಿಲ್ಲ
ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ನಾವು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.PCR ಅನೇಕ ತಾಪನ ಮತ್ತು ಅನೆಲಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಗುರಿಯ ತುಣುಕು ಘಾತೀಯವಾಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತದೆ;ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲದಿದ್ದರೂ, ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನವು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಒಂದರಿಂದ ಒಂದರಂತೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಅನೇಕ ತುಣುಕುಗಳಂತೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಬಹುದು.

cDNA ಮಾಹಿತಿಯ ಅನೇಕ ತುಣುಕುಗಳು ಇರುವುದರಿಂದ, ಅದನ್ನು ಈಗ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು, ಏಕೆಂದರೆ ದೊಡ್ಡ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಹಿಮ್ಮುಖವಾಗಿ ಪ್ರತಿಲೇಖಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಒಂದು ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುವುದು ಅಸಾಧ್ಯ.ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಪಡೆದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ, ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಇದು ವರ್ಧನೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಇದನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವುದು ಮೂಲತಃ ಅಸಾಧ್ಯ.

cDNA ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು
ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅನ್ನು ಒಂದರಿಂದ ಒಂದಕ್ಕೆ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಯಾವುದೇ ಕಂಪನಿಯಿಂದ ಯಾವುದೇ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಈ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸಾಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ.ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಳ ದಕ್ಷತೆಯು 30-50% ನಡುವೆ ಅಲೆದಾಡುತ್ತದೆ.ಇದೇ ವೇಳೆ, ನಾವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ, ಅದನ್ನು ನಾವು ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ನೋಡಲು ಬಯಸುತ್ತೇವೆ: 3 ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳು 2 ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುತ್ತವೆ, 6 ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳು 4 ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುತ್ತವೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಎಷ್ಟು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಲೋಡ್ ಮಾಡಿದರೂ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯು ಅಸ್ಥಿರವಾಗಿರುವ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ನಾವು ನೋಡಲು ಬಯಸುವುದಿಲ್ಲ.

ಆದ್ದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸುವುದು ಹೇಗೆ?ವಿಧಾನವು ತುಂಬಾ ಸರಳವಾಗಿದೆ, ನೀವು ಹೋಲಿಕೆ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಮಾಡಬೇಕಾಗಿದೆ: ಒಂದು RNA ಯ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ cDNA ಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡುವುದು, ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು cDNA ಗೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರೈಬ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುವ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮಾಡುವುದು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಪಡೆದ ಇಳಿಜಾರು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡಲು qPCR ಮಾಡಿ.ಉನ್ನತ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಯಾಗಿ, ನೀವು ಅದನ್ನು ಸೆಕೆಂಡುಗಳಲ್ಲಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.ಕೆಳಗೆ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ:

ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ದಕ್ಷತೆಯು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು RNA ಮತ್ತು cDNA ಯ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ
ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಕಿಟ್
ಪರಿಪೂರ್ಣ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಹೇಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಮೂಲಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಎರಡು ವಿಧಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ, AMV ಅಥವಾM-MLV, ಮತ್ತು ಅವರ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯು ಕೋಷ್ಟಕದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ.

RNase H ಚಟುವಟಿಕೆ
RNase H ಎಂಬುದು ರೈಬೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ H ಆಗಿದೆ, ಚೀನೀ ಹೆಸರು ರೈಬೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ H ಆಗಿದೆ, ಇದು ಎಂಡೋರಿಬೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಡಿಎನ್‌ಎ-ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಸರಪಳಿಯಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜ್ ಮಾಡಬಹುದು.RNase H ಏಕ-ತಂತಿ ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಅಥವಾ RNA ಯಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೋಡೈಸ್ಟರ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಜ್ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಅಂದರೆ, ಇದು ಏಕ-ಎಳೆಯ ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಅಥವಾ RNA ಅನ್ನು ಜೀರ್ಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.cDNA ಯ ಎರಡನೇ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಅದೊಂದು ವಿಚಿತ್ರ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಹೇಳುತ್ತೇವೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ RNase H ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು RNase H ಅನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದೇ ಇರಬಹುದು, ಬಹುಶಃ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಕೆಲವು ಗುಂಪುಗಳ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ ಈ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ.

ಆದ್ದರಿಂದ, AMV ಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಅದರ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯು cDNA ಯ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, cDNA ಯ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೊಡೆದುಹಾಕಲು ಕಾರಕ ತಯಾರಕರು ನಿರಂತರವಾಗಿ ತಮ್ಮ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸುತ್ತಿದ್ದಾರೆ.
ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ

ವಿವಿಧ ತಾಪಮಾನಗಳಲ್ಲಿ RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆ
ವಿಭಿನ್ನ ತಾಪಮಾನಗಳಲ್ಲಿ RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಾಗಿ ಮೇಲಿನ ಚಿತ್ರವನ್ನು ನೋಡಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಗುರಿಯ ತುಣುಕಿನ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು mFold ಆನ್‌ಲೈನ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿ.55 ° C ನಲ್ಲಿ, RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಇನ್ನೂ ತುಂಬಾ ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಕೆಲಸ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು 65 ° C ವರೆಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ AMV ಮತ್ತು M-MLV ಯ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತಾಪಮಾನವು ಈ ತಾಪಮಾನಕ್ಕಿಂತ ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.
ಏನ್ ಮಾಡೋದು?ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪೂರಕ ಜೋಡಣೆಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಡುವೆ ಬಲವಾದ ಸ್ಪರ್ಧೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ ಇ ಮತ್ತು ಕಳಪೆ ಪುನರಾವರ್ತನೀಯತೆಯಂತಹ ಸಮಸ್ಯೆಗಳ ಸರಣಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.

ಏನ್ ಮಾಡೋದು?ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.

ಅನೇಕ ಕಾರಕ ತಯಾರಕರು ಜೆನೆಟಿಕ್ ಇಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ತಮ್ಮ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತಿದ್ದಾರೆ.ಕೆಲವರು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತಾರೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಜಿಫಾನ್ ಮತ್ತು ಐಡೆಲೈ, ಮತ್ತು ಕೆಲವರು ಕಿಣ್ವ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಆರ್‌ನೇಸ್ ಎಚ್ ಕಿಣ್ವದ ಸಕ್ರಿಯ ಗುಂಪನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತಾರೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಬಾಂಧವ್ಯವು ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕವಾಗಿ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ಹಿಂಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಸಲೀಸಾಗಿ ಓದಬಹುದು ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶ: ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಹೆಚ್ಚು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ (ಕಿಣ್ವಗಳು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿರಬಾರದು ಆದರೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರಬೇಕು), ಬದಲಿಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಾದರಿಯ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ-ಪ್ರಮಾಣದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಅಲ್ಲ, ಅದು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಬಹು ಸಿಡಿಎನ್ಎಗಳು.
ವಿವಿಧ ತಯಾರಕರು ಸ್ಥಿರತೆಯ ಅನ್ವೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಪ್ರಯತ್ನಗಳನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದಾರೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಂಪನಿಗಳು ಈಗ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅನ್ನು ಮಾರಾಟಕ್ಕೆ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕಿಟ್‌ನಂತೆ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಿದ್ದು, ಇದು ಉತ್ತಮ ಆಯ್ಕೆಯಾಗಿದೆ.
ಉದಾಹರಣೆಗೆ, Foregene ನ RT ಸುಲಭ ಸರಣಿ ಕಿಟ್‌ಗಳು:

RT ಈಸಿ I (ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಕಿಟ್‌ಗಾಗಿ ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರಿಮಿಕ್ಸ್)

MIQE (5) - ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮಾಹಿತಿ

ಮೇಲಿನ ಚಿತ್ರವು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ
1. ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಈ ಜೀನ್ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು.
2. ಜೀನ್ ಐಡಿ, ನಿಮಗೆ ತಿಳಿದಿದೆ.
3. ಜೀನ್ ಉದ್ದ, ಗುರಿಯ ವಂಶವಾಹಿಯ ಒಟ್ಟು ಉದ್ದವು ಖಂಡಿತವಾಗಿಯೂ ಯಾವುದೇ ತೊಂದರೆಯಿಲ್ಲ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವಾಗ, ಉತ್ತಮ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ನ ಉದ್ದವು 80-200bp ನಡುವೆ ಇದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.
4. ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಹೋಲಿಕೆ ಮಾಹಿತಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಜೀನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೋಲಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.
5. ಸ್ಯೂಡೋಜೆನ್ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ.ಒಂದು ಸ್ಯೂಡೋಜಿನ್ ಸಾಮಾನ್ಯ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಹೋಲುವ ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿದೆ ಆದರೆ ಅದರ ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಇದು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟ್‌ಗಳ ಬಹು-ಜೀನ್ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿದೆ.ಇದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ψ ನಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇದು ಜೀನೋಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರತಿಯಾಗಿದ್ದು ಅದು ಕೋಡಿಂಗ್ ಜೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ., ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಲಿಪ್ಯಂತರವಲ್ಲ ಮತ್ತು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಶಾರೀರಿಕ ಅರ್ಥವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ.
6. ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನ.ಆರಂಭಿಕ ವರ್ಷಗಳಲ್ಲಿ, ನಾವು ಡಿಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯದ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಿದಾಗ, ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳಿಗೆ ಗಮನ ಕೊಡುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳಾದ್ಯಂತ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುವುದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಿದ್ದೇವೆ.ದಯವಿಟ್ಟು ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವನ್ನು ನೋಡಿ: ಕಪ್ಪು ಇಂಟ್ರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ವಿವಿಧ ಬ್ಲೂಗಳು ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ, ಗುಲಾಬಿ ಸಾಮಾನ್ಯ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣವು ಇಂಟ್ರಾನ್-ಸ್ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.

ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್, ಎಂದಿಗೂ ನಿಜವಲ್ಲ
ಇದು ಎಂತಹ ಪರಿಪೂರ್ಣ ಯೋಜನೆ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಟ್ರಾನ್ಸ್-ಇಂಟ್ರಾನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಊಹಿಸಿದಷ್ಟು ಮಾಂತ್ರಿಕವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಅವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಉತ್ತಮ ಮಾರ್ಗವೆಂದರೆ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು.
7. ಕನ್ಫರ್ಮೇಶನ್ ಪ್ರಿಡಿಕ್ಷನ್.ಈ ಉದಾಹರಣೆಯನ್ನು ಮತ್ತೊಮ್ಮೆ ಬಳಸಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಗುರಿಯ ತುಣುಕಿನ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು mFold ಆನ್‌ಲೈನ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿ.

ವಿವಿಧ ತಾಪಮಾನಗಳಲ್ಲಿ RNA ಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆ
ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪೂರಕ ಜೋಡಣೆಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಜೋಡಣೆಯ ನಡುವೆ ಪ್ರಬಲ ಪೈಪೋಟಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಸಾಧ್ಯತೆಗಳು ಕಡಿಮೆ, ಕಡಿಮೆ ಇ ಮತ್ತು ಕಳಪೆ ಪುನರಾವರ್ತನೀಯತೆಯಂತಹ ಸಮಸ್ಯೆಗಳ ಸರಣಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಮುನ್ಸೂಚನೆಯ ಮೂಲಕ, ಯಾವುದೇ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಅದು ಉತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಇದ್ದರೆ, ನಮ್ಮ ಮುಂದಿನ ಲೇಖನವು ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ಪರಿಹರಿಸಬೇಕೆಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಚರ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.

MIQE (6)-qPCR ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಸ್

ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಗಾಗಿ, ನೀವು ಪ್ರತಿದಿನ ಹೋರಾಡುವ ಮೊದಲ ವಿಷಯವೆಂದರೆ RNA ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ, ಮತ್ತು ಎರಡನೆಯದು ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸವಾಗಿರಬಹುದು.
ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, MIQE ಪರಿಶೀಲನಾಪಟ್ಟಿಯ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ನಿಯಮಗಳನ್ನು ನಾವು ಇನ್ನೂ ಪರಿಶೀಲಿಸುತ್ತೇವೆ.ಇದು ತುಂಬಾ ಸರಳವಾಗಿದೆ, ಸ್ಕಂಬಾಗ್‌ಗಳು ನಗಬಹುದು, ಮತ್ತು ನಾವು ಅದನ್ನು ಒಂದೇ ವಾಕ್ಯದಲ್ಲಿ ಮುಗಿಸಬಹುದು: ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೋಬ್‌ನ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಸ್ಥಾನ ಮತ್ತು ಮಾರ್ಪಾಡು ವಿಧಾನವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಿರಿ.ಪ್ರೈಮರ್ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನಕ್ಕಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಪ್ರಸ್ತುತ ತುಂಬಾ ಅಗ್ಗವಾಗಿದೆ, qPCR PAGE ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಯೋಗ್ಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಉಪಕರಣದ ಮಾಹಿತಿಯು ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ.ಅನೇಕ ಜನರು ದಶಕಗಳಿಂದ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದಾರೆ ಮತ್ತು ಸಿಂಥಸೈಜರ್ ABI3900 ಎಂದು ತಿಳಿದಿಲ್ಲ.
ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ತತ್ವಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ನೀವು ಅವುಗಳನ್ನು ಕಂಠಪಾಠ ಮಾಡಬೇಕಾಗಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅಥವಾ ಆನ್‌ಲೈನ್ ಪರಿಕರಗಳು ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು (ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾದ ಆನ್‌ಲೈನ್ ಟೂಲ್ ಪ್ರೈಮರ್3.ut.ee/), ಮತ್ತು 99.999% ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ ನೋಡಿ, ಲೇಖಕರು ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ನೂರಾರು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುತ್ತಾರೆ.
ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿ:
1. 3′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಸಮೀಪವಿರುವ ವಿನ್ಯಾಸ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು: cDNA ಫಸ್ಟ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್‌ಗಾಗಿ ಒಲಿಗೊ dT ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿ, ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು 3′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಹತ್ತಿರವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.ಕೆಳಗಿನಂತೆ ವಿವರಿಸಲು ಚಿತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ (ಇದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಯಾವುದೇ ಮಾರ್ಗವಿಲ್ಲ):

ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು 3′ ಅಂತ್ಯದ ಹತ್ತಿರ ಏಕೆ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕು, ಅದು ನಿಜವಾಗಿರಬಾರದು
2. TM ಮೌಲ್ಯ: Tm ಮೌಲ್ಯವು 55-65 ° C ನಲ್ಲಿದೆ (ಏಕೆಂದರೆ ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು 60 ° C ನಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಧಿಕವಾಗಿದೆ), ಮತ್ತು GC ವಿಷಯವು 40% -60% ನಲ್ಲಿದೆ.
3. ಬ್ಲಾಸ್ಟ್: ಜೀನೋಮ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು, ಪೂರಕ ಪರಿಶೀಲನೆಗಾಗಿ ಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು.

MIQE(7)-qPCR ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ

1. qPCR ಕಿಟ್
MIQE ಯ ಅಗತ್ಯತೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಸಂರಚನೆ, ಯಾವ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ತಯಾರಕರು ಯಾರು, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ ಎಷ್ಟು ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ, ಡೈ ವಿಧಾನ ಅಥವಾ ಪ್ರೋಬ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆಯೇ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಲೇಖನದಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ನಾವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ವಿವರಿಸಬೇಕು.ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವವರೆಗೆ, ಮೇಲಿನ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಮೂಲತಃ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಅನುಭವಿ ಚಾಲಕರು ಖಂಡಿತವಾಗಿ ಕಂಡುಕೊಳ್ಳುತ್ತಾರೆ.
ಪ್ರಸ್ತುತ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಕಿಟ್‌ಗಳ ತಯಾರಿಕೆ ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದನೆಯು ಬಹಳ ಪ್ರಬುದ್ಧ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವಾಗಿದೆ.ನೀವು ಅತ್ಯಂತ ಕೆಟ್ಟ ತಯಾರಕರನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡದಿರುವವರೆಗೆ, ಸಮಸ್ಯೆಗಳ ಸಂಭವನೀಯತೆ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ನಾವು ಇನ್ನೂ ಕೆಲವು ಅಂಶಗಳನ್ನು ನಿಮ್ಮೊಂದಿಗೆ ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳಲು ಬಯಸುತ್ತೇವೆ:
ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಾಕ್ ಕಿಣ್ವ:ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಪ್ರಮುಖ ಭಾಗವೆಂದರೆ ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಾಕ್ ಕಿಣ್ವ.ಮಾರುಕಟ್ಟೆಯಲ್ಲಿನ ಬಿಸಿ-ಪ್ರಾರಂಭದ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಎರಡು ವಿಧಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ಒಂದು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಬಿಸಿ-ಪ್ರಾರಂಭದ ಕಿಣ್ವವಾಗಿದೆ (ನೀವು ಇದನ್ನು ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್ ಎಂಬೆಡಿಂಗ್ ಎಂದು ಊಹಿಸಬಹುದು), ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಪ್ರತಿಕಾಯ ಮಾರ್ಪಾಡಿಗಾಗಿ (ಆಂಟಿಜೆನ್-ಆಂಟಿಬಾಡಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್) ಬಿಸಿ-ಪ್ರಾರಂಭದ ಕಿಣ್ವವಾಗಿದೆ.ರಾಸಾಯನಿಕ ಮಾರ್ಪಾಡು ಬಿಸಿ-ಪ್ರಾರಂಭದ ಕಿಣ್ವಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಮಾರ್ಗವಾಗಿದೆ.ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, ಕಿಣ್ವವು ಅದರ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಬಿಸಿ-ಪ್ರಾರಂಭದ ಕಿಣ್ವವು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲು ಜೈವಿಕ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಆಗಿ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕಾರ್ಯರೂಪಕ್ಕೆ ತರಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇದರಿಂದ ಏನು ಪ್ರಯೋಜನ?ಇದೇ ರೀತಿಯಾಗಿ, ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಕಿಣ್ವಗಳ ಬಿಡುಗಡೆಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗಿಂತ ವೇಗವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯ ದೃಷ್ಟಿಯಿಂದ, ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಕಿಣ್ವಗಳು ಸ್ವಲ್ಪ ಪ್ರಯೋಜನವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಮಾರುಕಟ್ಟೆಯಲ್ಲಿ ಕಿಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಕಿಣ್ವಗಳು ಮೂಲತಃ ಇರುವುದಿಲ್ಲ.ಇದ್ದರೆ, ಈ ತಯಾರಕರ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವು ಇನ್ನೂ ಸಹಸ್ರಮಾನದ ಯುಗದಲ್ಲಿ ಸಿಲುಕಿಕೊಂಡಿದೆ.
ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆ:ಪಿಸಿಆರ್ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ಸೂಕ್ತವಾದ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಟಾಕ್ ಕಿಣ್ವ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಬಿಡುಗಡೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ.ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ;ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಕಿಣ್ವ-ವೇಗವರ್ಧಿತ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ.ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅನೆಲಿಂಗ್, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ವರ್ಧಿತ ತುಣುಕುಗಳ ಇಳುವರಿ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 25mM ನಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, ಉತ್ತಮ ಕಿಟ್ಗಾಗಿ, ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು.ಕೆಲವು ವ್ಯಾಪಾರಿಗಳು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಐಯಾನ್ ಚೆಲೇಟಿಂಗ್ ಏಜೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಕಾರಕಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸುತ್ತಾರೆ, ಇದು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅಯಾನು ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು.
ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ಸಾಂದ್ರತೆ:ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ SYBR ಗ್ರೀನ್ ಆಗಿರುವ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಸಣ್ಣ ಗ್ರೂವ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಡೈ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ, ಅಂದರೆ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅದರೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಾಗ, ಡಿಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಂಕೇತ.
PS: ಅದರ ಬೆಳಕಿನ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಂದಾಗಿ, ಮಾರುಕಟ್ಟೆಯಲ್ಲಿ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಂದು ಅಪಾರದರ್ಶಕ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ).ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇದು ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಎದುರಿಸಲಿದೆ.ಮಾದರಿ ಮಾಡುವಾಗ ದ್ರವವನ್ನು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡುವುದು ಕಷ್ಟ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ಕ್ವಿಂಗ್ಕೆ ಅತ್ಯಂತ ಬಳಕೆದಾರ ಸ್ನೇಹಿಯಾಗಿದೆ (ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ), ಮತ್ತು ಪಾರದರ್ಶಕ ಟ್ಯೂಬ್ ಅನ್ನು ಅಪಾರದರ್ಶಕ ಟಿನ್ ಬ್ಯಾಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ ಅದನ್ನು ತವರ ಚೀಲಕ್ಕೆ ಹಾಕಿ, ಬೆಳಕು ಮತ್ತು ಮಾದರಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುವ ಅನುಕೂಲವನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡು.ನೀವು ಸರಿಯಾದ ಉತ್ಪನ್ನ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಆರಿಸಬೇಕು.TSE204 ಒಂದು ಸೂಪರ್ ವೆಚ್ಚ-ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಅಸ್ತಿತ್ವವಾಗಿದೆ, ಇದು ನನಗೆ ಹುಲ್ಲು ನೆಡಲು ಬಯಸುವಂತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವರ್ಣದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಹ ಬಹಳ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ನಂತರದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ವರ್ಧನೆಯ ರೇಖೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪರಿಪೂರ್ಣವಲ್ಲ;ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಅದು ಶಬ್ದದ ಅಡಚಣೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಮುಖ್ಯವಾಗಿ CT ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುವುದರಿಂದ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವರ್ಣದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸರಿಯಾಗಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸದಿದ್ದರೆ, ಕಡಿಮೆ ಬಿಂದುವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಬಿಂದುಕ್ಕಿಂತ ಉತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಡೈ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.

ROX: ROX ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ-ಬಾವಿಯ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಿಗ್ನಲ್ ದೋಷಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕೆಲವು ಉಪಕರಣ ತಯಾರಕರಿಗೆ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇತರರು ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, Thermo Fisher Scientific ನ ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ PCR ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಉಪಕರಣದ ಬಳಕೆಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ಇತ್ಯಾದಿ ಸೇರಿದಂತೆ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಿಟ್ ಸೂಚನೆಗಳು ಅದನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ.
ಫೋರ್ಜೀನ್‌ನ qPCR ಮಿಶ್ರಣವು ROX ಡೈ ಅನ್ನು ಸಹ ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ವಿವಿಧ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲು ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ.

ರಿಯಲ್ ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್-ತಕ್ಮನ್

ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧ ಚಿಕಿತ್ಸೆ: ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ತಾಂತ್ರಿಕ ವಿಷಯವಾಗಿದೆ.ಅನೇಕ ಕಿಟ್‌ಗಳ ಕೈಪಿಡಿಗಳನ್ನು ಯಾವುದೂ ಓದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೂ ಈ ವಿಷಯವನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಿಲ್ಲ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಇದು ತುಂಬಾ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ನೆಲೆಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳ ಬಲವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ.ಬಲವಾದ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯ ವರ್ಧನೆ, ಮತ್ತು ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ.ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗದಿದ್ದರೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಲೇಖಕರ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ, ಕೆಲವೇ ಕಂಪನಿಗಳು ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿವೆ.ನೀವು ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಖರೀದಿಸಿದಾಗ, ನೀವು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಬಯಸುವ ಕಿಟ್‌ಗೆ ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿದ್ದೀರಾ ಎಂದು ನೀವು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಬಹುದು.

ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣ: 20-50ul ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಸಂಪುಟಗಳು ದೋಷಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಕಿಟ್ ಸೂಚನೆಗಳು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸಂಪುಟಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಸ್ಮಾರ್ಟ್ ಆಗಿರಬೇಡಿ ಮತ್ತು ವೆಚ್ಚವನ್ನು ಉಳಿಸಲು ಸಣ್ಣ ಸಂಪುಟಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.ಗುರಿ.ವ್ಯಾಪಾರಿಗಳು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಸಂಪುಟಗಳಿಂದ ಉಂಟಾದ ದೋಷಗಳ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಅವರು ಪರಿಹರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಿರಬಹುದು.
2. ಟ್ಯೂಬ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ತಯಾರಕ ಮತ್ತು ಲೇಖನ ಸಂಖ್ಯೆ
ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್ ತತ್ವ ಎಲ್ಲರಿಗೂ ತಿಳಿದಿದೆ.ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಗ್ರಹವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ PCR ಟ್ಯೂಬ್ ಕ್ಯಾಪ್ಗಳ ಮೂಲಕ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪಿಸಿಆರ್ ಉಪಭೋಗ್ಯವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವಾಗ, ಎರಡು ಅಂಶಗಳಿಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಿ: ಉತ್ತಮ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಸರಣ ಮತ್ತು ಉಪಕರಣಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮುಖ್ಯವಾಹಿನಿಯ ಬ್ರ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳ ಬೋರ್ಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು ಉತ್ತಮವಾಗಿವೆ, ಆದರೆ ನೀವು ಅಳವಡಿಕೆಯ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಆರಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ನೀವು ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

4. ಉನ್ನತ ಮಟ್ಟದ ಜ್ಞಾನ

MIQE (8)-qPCR ಮೌಲ್ಯೀಕರಣ
ಇದು qPCR ನ ಪ್ರಮುಖ ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿದೆ!ಎಷ್ಟೋ ವೀರರು ಇಲ್ಲಿ ಮರಳಿನಲ್ಲಿ ಬಿದ್ದಿದ್ದಾರೆ.ಸಹಜವಾಗಿ, ನೀವು ಅದೃಷ್ಟವಂತರು ಮತ್ತು ನೀವು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಸರಳವಾಗಿರುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ನೀವು ಗಾಳಿಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಐಸ್ ಗುಹೆಯ ಮೂಲಕ ತೇಲುತ್ತೀರಿ.qPCR ನ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮಾಹಿತಿಯು ಡೇಟಾದ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಉದ್ದೇಶಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಾವು ಅಗತ್ಯ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ:

1.ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಪರೀಕ್ಷೆ
ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಚಿತ್ರವು ಒಂದೇ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಆಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ಗುರಿ ಜೀನ್ ವರ್ಧನೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ;ಅನುಕ್ರಮ ಪರಿಶೀಲನೆ;ಶಿಖರದ ನಕ್ಷೆ ಏಕವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡಲು ಕರಗುವ ವಕ್ರರೇಖೆ;ಕಿಣ್ವ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮತ್ತು ಇತರ ವಿಧಾನಗಳು.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ಟಿ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುತ್ತೇವೆಕರಗುವ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ನಾವು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ಉತ್ಪನ್ನದ ತುಣುಕಿನ ಗಾತ್ರವು 80-200bp ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿರಬೇಕು, ಇದು PCR ಉತ್ಪನ್ನದ ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 80-85 °C ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ವಿವಿಧ ಶಿಖರಗಳು ಇದ್ದರೆ, ಇತರ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಇರಬೇಕು;ಗರಿಷ್ಠವು 80 ° C ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಕಂಡುಬಂದರೆ, ಅದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ;ಶಿಖರವು 85 ° C ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಅದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ DNA ಮಾಲಿನ್ಯ ಅಥವಾ ದೊಡ್ಡ ತುಣುಕುಗಳ ಹೆಚ್ಚು ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗಮನಿಸಿ: ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ 80 ° C ನಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಒಂದು ಶಿಖರ ಇರುತ್ತದೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಈ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರಬೇಕು.ವರ್ಧನೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳಾಗಿರಬಹುದು.

ಸಾಮಾನ್ಯ ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ (ಯಾವುದೇ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯೊಂದಿಗೆ ಏಕ ಶಿಖರ)

ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕ ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ (ಸ್ಪೂರ್ಯಸ್ ಶಿಖರಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ)
【ಪ್ರಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ】

ಮುಖ್ಯ ಶಿಖರವಿದೆ, ಆದರೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಗಂಭೀರವಾಗಿದೆ
ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಸಿಂಗಲ್-ಪೀಕ್ ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ ನಿಮ್ಮ ಕಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಮೋಸಗೊಳಿಸಬಹುದು, ಇದು ಪರಿಪೂರ್ಣ ಪ್ರಯೋಗವೆಂದು ಭಾವಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಫಲಿತಾಂಶವು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತಪ್ಪಾಗಿದೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಕರಗುವ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ನೋಡಬೇಕು.ಗರಿಷ್ಠ ತಾಪಮಾನವು 80 ° C ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದೆ, ಇದು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ ಆಗಿದೆ.

ಗುರಿಯ ತುಣುಕು ಇಲ್ಲ, ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳು
ಇಲ್ಲಿ, ನನ್ನ ಸಹೋದರ ನಿಲ್ಲಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವು ಮೊಬೈಲ್ ಫೋನ್‌ನಿಂದ ತೆಗೆದ ಫೋಟೋವಾಗಿದ್ದು ನನಗೆ ಕಳಂಕಿತರು ಕಳುಹಿಸಿದ್ದಾರೆ.ಅವರು ಬಳಸಿದ ಕಾರಕಗಳೆಲ್ಲವೂ ಉದ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಬ್ರ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳಾಗಿವೆ.ಅವರು ಒಂದು ಟಿ-ಪ್ರಿಫಿಕ್ಸ್ ಬ್ರ್ಯಾಂಡ್‌ನಿಂದ ಮತ್ತೊಂದು ಟಿ-ಪ್ರಿಫಿಕ್ಸ್ ಬ್ರ್ಯಾಂಡ್‌ಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿದರು.ನೀವು ಈಗಾಗಲೇ ಊಹಿಸಿದ್ದೀರಿ ಎಂದು ನಾನು ಭಾವಿಸುತ್ತೇನೆ.ಕೊಳಕು ನನಗೆ ಅಳುತ್ತಾನೆ: “ಮೊದಲ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಕಾರಕವು ತುಂಬಾ ಚೆನ್ನಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಶಿಖರವು ಒಂದೇ ಆಗಿದೆ.ನಂತರ, ನೀವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ಕಾರಕವನ್ನು ಬಳಸಿದ ನಂತರ, ಇದು ಮಿಶ್ರ ಶಿಖರಗಳೊಂದಿಗೆ ಎರಡನೇ ಚಿತ್ರದಂತೆ ಆಗುತ್ತದೆ.ನೀನು ನನ್ನನ್ನು ದುಃಖಿತನನ್ನಾಗಿ ಮಾಡಿದೆ."
ಎರಡು ಗ್ರಾಫ್ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ.ಮೊದಲ ನೋಟದಲ್ಲಿ, ಒಂದು ಒಂದೇ ಶಿಖರವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಎರಡು ಶಿಖರವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಅಸಂಬದ್ಧ, ಒಂದೇ ಶಿಖರವು ಸಹಜವಾಗಿ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ಅದು ನಿಜವೇ?
Dou E ಗಿಂತ ಕೆಟ್ಟದಾಗಿದೆ, ನಾನು ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಎರಡು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಹಾಕಿದರೆ, ನಿಮಗೆ ತಕ್ಷಣ ಅರ್ಥವಾಗುತ್ತದೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಈ ರೀತಿಯ ಚಿತ್ರದಿಂದ ನಾವು ಸುಲಭವಾಗಿ ಪಾರ್ಶ್ವವಾಯುವಿಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತೇವೆ.ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ: ಮೊದಲ ಫಿಗರ್ನ ಗರಿಷ್ಠವು 75 ° C ನಲ್ಲಿದೆ, ಇದು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಆಗಿದೆ;ಎರಡನೆಯ ಆಕೃತಿಯ ಉತ್ತುಂಗವು 75 ° C ಮತ್ತು 82 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಕನಿಷ್ಠ ಉತ್ಪನ್ನವು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.

ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಚಿತ್ರಗಳು
ಆದ್ದರಿಂದ ಮೂಲಭೂತ ಸಮಸ್ಯೆ ಕಾರಕಗಳ ಸಮಸ್ಯೆಯಲ್ಲ, ಆದರೆ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸದ ಸಮಸ್ಯೆ.ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕೆಲವು ದೊಡ್ಡ ಬ್ರ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಕಬ್ಬಿಣದ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸಹ ಇದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನನ್ನ ಸಹೋದರನು ಮೊದಲು ಹೇಳಿದ್ದನ್ನು ಇದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸುತ್ತದೆ: ಇದು ನಿಮ್ಮ ಲೇಖನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುವ ಕಾರಕ ಬ್ರಾಂಡ್ ಅಲ್ಲ.ನಿಮ್ಮ ಲೇಖನವೇ ಕಾರಕಗಳ ಬ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಎತ್ತಿ ಹಿಡಿದಿದೆ.ಕೇವಲ ಊಹಿಸಿ, ಸ್ಕಂಬ್ಯಾಗ್ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸದಿದ್ದರೆ, ತಪ್ಪಾದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಜರ್ನಲ್ಗೆ ಕಳುಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಏನಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬುದು ದುರಂತವಾಗಿದೆ.
2. ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ Ct ಮೌಲ್ಯ
ವಿವರಿಸಬೇಡಿ, ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣವು Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಅದು ಮಾಲಿನ್ಯವಲ್ಲವೇ?ಆದಾಗ್ಯೂ, ಯಾವ ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣವು Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನೀವು ಇನ್ನೂ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.ಇದು NTC ಆಗಿದ್ದರೆ, ಕಾರಕ ಮಾಲಿನ್ಯದಂತಹ ವಿದೇಶಿ DNA ಇದೆ ಎಂದು ಅರ್ಥ.ಇದು NRT ಆಗಿದ್ದರೆ, ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNA ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಅರ್ಥ.
3. ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್
ಇಳಿಜಾರು ಮತ್ತು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಸೂತ್ರವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ, ಪಿಸಿಆರ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸೂತ್ರದ ಮೂಲಕ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.ಒಂದು ಪರಿಪೂರ್ಣ ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕೆ 3.32 ಅನ್ನು ಸಮೀಪಿಸಲು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯ ಇಳಿಜಾರು ಮತ್ತು 0.9999 ಅನ್ನು ಸಮೀಪಿಸಲು R² ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.
4. ಲೀನಿಯರ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಶ್ರೇಣಿ
ಕ್ರಿಯೆಯ ಡೈನಾಮಿಕ್ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ರೇಖೀಯವಾಗಿದೆ.ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಬಳಸುವ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರಕಾರ, ಡೈನಾಮಿಕ್ ಶ್ರೇಣಿಯು ಕನಿಷ್ಟ 5 ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಇಳಿಜಾರುಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಇಳಿಜಾರುಗಳು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಇಳಿಜಾರುಗಳಲ್ಲಿ Ct ಮೌಲ್ಯಗಳ ಬದಲಾವಣೆಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು.
5. ಪತ್ತೆ ನಿಖರತೆ
qPCR ಫಲಿತಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು, ಅಂದರೆ, ಕಳಪೆ ಪುನರಾವರ್ತನೆ, ಅಂದರೆ ಕಳಪೆ ನಿಖರತೆ, ತಾಪಮಾನ, ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆ ಸೇರಿದಂತೆ ಹಲವು ಅಂಶಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆ.ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ ಕಡಿಮೆಯಾದಂತೆ qPCR ನಿಖರತೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ.ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಬದಲಾವಣೆಯೊಳಗೆ, ಈ ತಾಂತ್ರಿಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ಜೈವಿಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಿಂದ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು ಗುಂಪುಗಳು ಅಥವಾ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ qPCR ಫಲಿತಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಬಹುದು.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗಾಗಿ, ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಪರೇಟರ್‌ಗಳಾದ್ಯಂತ ಉತ್ತಮ ಅಂತರ-ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ನಿಖರತೆಯನ್ನು (ಪುನರಾವರ್ತನೆ) ವರದಿ ಮಾಡಬೇಕು.
6. ಪತ್ತೆ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು LOD (ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ qPCR ನಲ್ಲಿ)
ಪತ್ತೆಯಾದ ಧನಾತ್ಮಕ ಮಾದರಿಗಳ 95% ರಷ್ಟು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯು LOD ಆಗಿದೆ.ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಗುರಿಯ ಜೀನ್ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಗುಂಪಿನೊಳಗೆ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ LOD ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ವಿಫಲವಾದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ 5% ಅನ್ನು ಮೀರಬಾರದು.ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ qPCR ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡುವಾಗ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಪಾಯಿಂಟ್ ಮ್ಯುಟೇಶನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಪಾಲಿಮಾರ್ಫಿಸಮ್‌ಗಳ ಏಕಕಾಲಿಕ ಪತ್ತೆಗಾಗಿ, ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ qPCR ಒಂದೇ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಹು ಗುರಿ ತುಣುಕುಗಳ ನಿಖರತೆಯು ರಾಜಿಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಬಹು ಪತ್ತೆ ಮತ್ತು ಏಕ ಟ್ಯೂಬ್ ಪತ್ತೆ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು LOD ಒಂದೇ ಆಗಿರಬೇಕು.ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಿದಾಗ, ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು.
ಸಮಸ್ಯೆಗಳು ಮತ್ತು ಪರಿಹಾರಗಳುಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, qPCR ಡೀಬಗ್ ಮಾಡುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಎದುರಾಗುವ ಸಮಸ್ಯೆಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಅಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುತ್ತವೆ:
· ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ
ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ತೊಂದರೆ
· ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ
· ಸೆಕೆಂಡರಿ ರಚನೆಯು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ
ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ
ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ , ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸವು ಸೂಕ್ತವಲ್ಲ ಎಂದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ನೀವು ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲು ಆತುರವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಮೊದಲು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಬಹುದು (ತತ್ವವನ್ನು ಸಹ ಲಗತ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ):
· ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ - ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಂತೆ ಮಾಡಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ;
ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಉದ್ದನೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ - ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ;
· ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ - ಅನಗತ್ಯ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗುರಿಯಿಲ್ಲದ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ;
ಕಡಿಮೆ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ
ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿ - ಕಡಿಮೆ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆ , ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಎದುರಿಸಲು ಕ್ರಮಗಳು ಕೇವಲ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿರುತ್ತವೆ:
· ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಉದ್ದನೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಿ;
ಮೂರು-ಹಂತದ PCR ಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ ಮತ್ತು ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ;
· ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ;
Ps: 90 ರ ದಶಕದಲ್ಲಿ ಜನಿಸಿದ ಅನೇಕ ಪದವೀಧರ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳು ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಡೀಬಗ್ ಮಾಡುವುದು ಹೇಗೆ ಎಂದು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಸಿದ್ಧರಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಕಿಟ್ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಭಾವಿಸುತ್ತೇವೆ (ಪದವಿ ನಂತರ ಸಂಶೋಧನೆ ಮತ್ತು ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮಾಡಲು ನೀವು ಕಾರಕ ಕಂಪನಿಗೆ ಹೋಗಲು ಬಯಸಿದರೆ), ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಕಾರಕ ತಯಾರಕರು ಸಹ ಈ ರೀತಿ ಯೋಚಿಸುತ್ತಾರೆ, ಇದು ಮೂರ್ಖತನ ಎಂದು ನಾನು ಭಾವಿಸುತ್ತೇನೆ, ನೀವು ಅದನ್ನು ಪಡೆದಾಗ ಅದನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಬಹುದು. ದುರ್ಬಲ H-ಬಾಂಡ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಅಂಶಗಳು.ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲು, ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಅಂಶವಿದೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡಲು ಮೂರ್ಖರು ಇನ್ನೂ ಕಾರಕ ಕಂಪನಿಯ ಪರಿಚಯವನ್ನು ಓದಬೇಕು.
ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ಗಳೊಂದಿಗೆ ತೊಂದರೆ
ವಿಧಾನ 1: ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, qPCR ಗಾಗಿ ಕಿಟ್ ಸೂಚನೆಗಳು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳು ಮತ್ತು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.
ವಿಧಾನ 2: ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಡೀಬಗ್ ಮಾಡುವುದು.ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಕಂಪನಿಯಿಂದ ಕದ್ದಿದೆ.ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವು ಮೂರು ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ಗಳು (100nM, 250nM, 500nM) ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ:

ಪ್ರೈಮರ್ ಏಕಾಗ್ರತೆಯ ಆಯ್ಕೆಯು ಪ್ರತಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಒಂದು ಸಾಲಿನಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಿ:

ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಆಯ್ಕೆಯು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ, 100nM ಮತ್ತು 250nM ನ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧವು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 500nM ನ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಳಪೆಯಾಗಿದೆ.100nM ಮತ್ತು 250nM ನಲ್ಲಿ, 250nM ನ Ct ಮೌಲ್ಯವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 250nM ಆಗಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ತೀವ್ರವಾದ ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಕರಗುವ ಕರ್ವ್ನಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು.ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಿದ್ದರೆ ಏನು?
ವಿಧಾನ 3: ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ (ವಿವರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ).
ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಮೌಲ್ಯವು 60 ° C ಆಗಿದೆ.ನಿಮಗೆ ಖಚಿತವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೇಗೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವುದು?ಉತ್ತರವು ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಆಯ್ಕೆಯಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ -ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಪರೀಕ್ಷೆ.ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ವಿವರಿಸಲು Bio-rad ಕಂಪನಿಯಿಂದ ಚಿತ್ರವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗುರಿಯ ತುಣುಕಿನ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ, ಎಂಟು ತಾಪಮಾನದ ಇಳಿಜಾರುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿಸಿ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಮೂರು ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳೊಂದಿಗೆ, ಮತ್ತು ಪಡೆದ ವರ್ಧನೆಯ ಕರ್ವ್ ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ:

ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದ ಆಯ್ಕೆ:
·70°C, 69°C-ಮೂಲತಃ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಯಾವುದೇ ವರ್ಧನೆ ಇಲ್ಲ.
· 67.3 ° C - ಪ್ರಾರಂಭದಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಪ್ರಮಾಣದ ವರ್ಧನೆ ಇದೆ, ಮತ್ತು Ct ಮೌಲ್ಯವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ.
·64.5°C——Ct ಮೌಲ್ಯವು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ.
60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ಮತ್ತು 55.0°C ನಲ್ಲಿ, Ct ಮೌಲ್ಯಗಳು ಮೂಲತಃ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಅಂತಿಮ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯಗಳು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿವೆ.
ಹೇಗೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವುದು?ತತ್ವ: ಮೊದಲ ತತ್ವವು ಹೆಚ್ಚಿನ Ct ಮೌಲ್ಯವಾಗಿದೆ.ಅದೇ Ct ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಾಗಿ, ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ತಪ್ಪಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.55 ° C ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮೌಲ್ಯವಿದ್ದರೂ, ಅದರಲ್ಲಿ ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ ಇರಬಹುದು.
ಆದರೆ ನೀವು ನಿಮ್ಮಂತೆಯೇ ಬುದ್ಧಿವಂತರಾಗಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಖಂಡಿತವಾಗಿಯೂ ಯೋಚಿಸುತ್ತೀರಿ: ತಾರ್ಕಿಕವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ತುಂಬಾ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಕನಿಷ್ಟ ಅವಶ್ಯಕತೆಯನ್ನು ಮೀರುವವರೆಗೆ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಟಿಪಿಗಳಂತೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಬಿಂದುಗಳು ಯಾವುದೇ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಹೊಂದುವವರೆಗೆ, Ct ಮೌಲ್ಯದ ಮೇಲೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸ್ವಾಭಾವಿಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಹೊಂದುವಂತೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು CT ಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ
ಸೆಕೆಂಡರಿ ರಚನೆಯು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ
ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ವಿವರಿಸಲು Bio-rad ನಿಂದ ಚಿತ್ರವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳೋಣ.ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಇದು ತಾಪಮಾನದ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಹ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.

ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ಹೊರಹೊಮ್ಮುತ್ತದೆ
ತಾಪಮಾನದ ಇಳಿಜಾರು ಕಡಿಮೆಯಾದಂತೆ, ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು Ct ಮೌಲ್ಯವು ಮುಂದಕ್ಕೆ ಚಲಿಸುತ್ತದೆ, ಕನಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು 60.7 ° C ಗೆ ತಲುಪುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ತಾಪಮಾನದ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಕಡಿಮೆಯಾದಂತೆ, Ct ಮೌಲ್ಯವು ದೊಡ್ಡದಾಗುತ್ತದೆ.ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಉಷ್ಣತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ, ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ತೆರೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರ, ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದರಿಂದ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಆದ್ದರಿಂದ,ಕಡಿಮೆ Ct ಮೌಲ್ಯದೊಂದಿಗೆ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ನೋಡಿ, ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಇದು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತಾಪಮಾನವಾಗಿದೆ!ಸಹಜವಾಗಿ, ಇದು ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವುದು ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುವುದು ಉತ್ತಮ ಎಂದು ಸ್ಮಾರ್ಟ್ ಮೂರ್ಖರು ತಿಳಿದಿರಬೇಕು.
5. ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್ ಮಟ್ಟ
MIQE - ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ

ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಉಪಕರಣದಿಂದ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹಿಂದಿನ ಲೇಖನದಲ್ಲಿ, ಪ್ರಯೋಗದ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಲಾದ ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣದಂತಹ ಬಹಳಷ್ಟು ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕೆಲಸವನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳು, ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಸಂಖ್ಯೆಗಳು ಇತ್ಯಾದಿಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ., ಇಲ್ಲಿ ನಾವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ qPCR ನ ಅನ್ವಯವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ.
qPCR ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ರೋಗನಿರ್ಣಯವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಸನ್ನಿವೇಶಗಳಾಗಿವೆ.
ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ
ಲಾಗ್ (ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆ) ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯೊಂದಿಗೆ ರೇಖಾತ್ಮಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ತಿಳಿದಿರುವ ಆರಂಭಿಕ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಎಳೆಯಬಹುದು, ಅಂದರೆ, ವರ್ಧನೆಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದು.ಮಾದರಿಯ Ct ಮೌಲ್ಯದ ಪ್ರಕಾರ, ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.ಸೇರಿಸಬೇಕಾದ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣ.

ಸಂಪೂರ್ಣ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ವಿಧಾನ
ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿರಬೇಕು.ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಮಾಡಲು, ಪ್ರಮಾಣಿತ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಮಾನದಂಡವು ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪಡೆದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಆಗಿದೆ.ಇದು ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಏಕೆ?ಏಕೆಂದರೆ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್ಎ ಅತ್ಯಂತ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುವ ಅನುಪಾತ (10-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ) ಪ್ರಕಾರ 5 ರಿಂದ 6 ಇಳಿಜಾರುಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ, ಮತ್ತು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಾಗ ಏಕರೂಪತೆಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಿ.Ct ಮೌಲ್ಯವು 15-30 ರ ನಡುವೆ ಬೀಳಲಿ.

ಪ್ರಮಾಣಿತ ಸಿದ್ಧತೆ
ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸಹ ಅದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬೇಕು (ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶವನ್ನು ನೆನಪಿಡಿ), ಮತ್ತು Ct ಮೌಲ್ಯವು 15-30 ರ ನಡುವೆ ಬೀಳಬೇಕು.ಪ್ರಮಾಣಿತ ಉತ್ಪನ್ನ + ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಯಂತ್ರದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಓಟದ ನಂತರ, ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಸ್ತುವಿನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ ತರಲಾಯಿತು.
ಹೆಪಟೈಟಿಸ್ ಬಿ ವೈರಸ್ HBV ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಒಂದು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣವಾಗಿದೆ, ಇದು 1ml ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಬಹುದು.
ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ
ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆ (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶ
ಮಾದರಿ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕ = ಬೇಸ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ × 324
ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ (ನಕಲುಗಳು/ಉಲ್) = ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆ / ಮಾದರಿಯ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕ × 6 × 1014

ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ವಿಧಾನ

ಮೇಲಿನವು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಇದು ಜೂನಿಯರ್ ಹೈಸ್ಕೂಲ್‌ನಿಂದ ಪದವಿ ಪಡೆದ ನಂತರ ಪರಿಹರಿಸಬಹುದಾದ ಗಣಿತದ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಗಣಿತದ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಂಪ್ಯೂಟರ್‌ಗಳಿಂದ ಪರಿಹರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಿಮಗೆ ಅರ್ಥವಾಗದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಸಂವಹನಕ್ಕೆ ಬರಬಹುದು.
ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ
ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.1 ಮಿಲಿ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಎಷ್ಟು ವೈರಸ್‌ಗಳಿವೆ, ಮತ್ತು ಇದು ಡಿಎನ್‌ಎ ವೈರಸ್, ಇದು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಘಟನೆಯಾಗಿದೆ: ರಕ್ತದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎ ವೈರಸ್ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಎಲೆಯಲ್ಲಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀನ್‌ನ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಪ್ರತಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೋಲಿಸುವುದು ನಮಗೆ ಕಷ್ಟ, ಏಕೆಂದರೆ ಎಲೆಯ ಗಾತ್ರ, ತೂಕ ಮತ್ತು ಮೃದುತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ, ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ, ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ, ಅಂದರೆ, ಯಾವುದೇ ಹಂತವು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.
ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಒಂದು ಅಂಶವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಬೇಕು:ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್
ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್ ನಡುವಿನ ಹೋಲಿಕೆಯಾಗಿದೆ.ಒಂದೇ ಅಂಗಾಂಶ ಮತ್ತು ಅದೇ ಕೋಶದಲ್ಲಿ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಮಾದರಿಯ ಗಾತ್ರ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಮಾಣ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ದಕ್ಷತೆಯ ಪ್ರಭಾವವು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ.ಸಣ್ಣ ಮಾದರಿ ಗಾತ್ರದ ಕಾರಣ, ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳೆರಡೂ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಇದಕ್ಕಾಗಿಯೇ ನಾವು ಈ ಹಿಂದೆ ಏಕರೂಪತೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆಗೆ ಒತ್ತು ನೀಡುತ್ತಿದ್ದೇವೆ.
ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್ಗಳು(ಹೌಸ್ ಕೀಪಿಂಗ್ ಜೀನ್‌ಗಳು), ಇದು ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀನ್‌ಗಳ ವರ್ಗವನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶಗಳ ಮೂಲಭೂತ ಜೀವನ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಅವುಗಳ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಅವಶ್ಯಕ.
ಈ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಗೊಂದಲಗೊಳಿಸಬೇಡಿ.ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಜೈವಿಕ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪದಗಳು, ಆದರೆ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ತಾಂತ್ರಿಕ ಪದಗಳಾಗಿವೆ.ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ಗಳಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವ ಮೊದಲು ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಮೌಲ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ರವಾನಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.
ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ವಿವಿಧ ಅಂಗಾಂಶ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ನಾವು ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ಮನೆಗೆಲಸದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು β-2-ಮೈಕ್ರೊಗ್ಲೋಬ್ಯುಲಿನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟಗಳು ಇತರ ಮೂರು ಜೀನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅವುಗಳನ್ನು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನ್‌ನ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ, ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್‌ನ ಪರಿಚಯದಿಂದಾಗಿ ಎರಡು ಕ್ರಮಾವಳಿಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
· ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ವಿಧಾನ
·2 – △△Ct ವಿಧಾನ (CT ಮೌಲ್ಯ ಹೋಲಿಕೆ ವಿಧಾನ)
ನೀವು ಜಾತಿಗಳು ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಆಸಕ್ತಿ ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ದಯವಿಟ್ಟು ಕ್ರಮಾವಳಿಗಳ ಸಂಶೋಧನೆಯನ್ನು ಬಿಟ್ಟುಬಿಡಿ ಮತ್ತು ಸೂತ್ರಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ನೇರವಾಗಿ ಯಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ;ನೀವು ಗಣಿತ ಮತ್ತು ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ನೇರ ವ್ಯಕ್ತಿಯಾಗಿದ್ದರೆ, ದಯವಿಟ್ಟು ಹಿಂಜರಿಯಬೇಡಿ.
ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕರ್ವ್ ವಿಧಾನ
ನಿಯಂತ್ರಣ ಮಾದರಿಯ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಹೌಸ್‌ಕೀಪಿಂಗ್ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯ ಮೂಲಕ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿ, ತದನಂತರ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವಾದ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಸೂತ್ರದ ಪ್ರಕಾರ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿ.
ಪ್ರಯೋಜನಗಳು: ಸರಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸರಳ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್
ಅನಾನುಕೂಲತೆ: ಪ್ರತಿ ಜೀನ್‌ಗೆ, ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಮಾಡಬೇಕು
ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್: ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಮತ್ತು ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು
ಸೂತ್ರವು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ:

ಉದಾಹರಣೆಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿವೆ:

ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಸಂಬಂಧಿತ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿ
2 - △△Ct ವಿಧಾನ (CT ಮೌಲ್ಯ ಹೋಲಿಕೆ ವಿಧಾನ)

ಪ್ರಯೋಜನಗಳು: ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಮಾಡುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ
ಅನಾನುಕೂಲಗಳು: ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 100% ಕ್ಕೆ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ;ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವು <5%, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ವರ್ಧನೆಯ ನಡುವಿನ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್ ಮತ್ತು ದಕ್ಷತೆಯು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ;ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಹೆಚ್ಚು ಜಟಿಲವಾಗಿದೆ.
ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್: ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಮತ್ತು ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು

ಸಹಜವಾಗಿ, ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಸಾಧ್ಯವಾಗಿದೆ 1. ತಿದ್ದುಪಡಿ ವಿಧಾನ: ಗುರಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖದ ಜೀನ್ ಒಂದೇ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಮಗೆ ತಿಳಿದಿದ್ದರೆ, ಆದರೆ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು 1 ಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ, ನಂತರ 2－△△Ct ಅನ್ನು ಹೀಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಬಹುದು: (1+E ) ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಸೂತ್ರವನ್ನು 1.95△△Ct ಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಬಹುದು
ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ವಿಷಯವು ಕೊನೆಗೊಂಡಿದೆ .